辛硫磷浇泼溶液体外透皮效果研究及临床药效试验

王 方，王晓宇

(沈阳伟嘉生物技术有限公司，辽宁 沈阳 110000)

辛硫磷，又称“肟硫磷” “克辛” “倍氰松”[1]，是一种广谱、低毒、高效、低残留的有机磷农药[2，3]，是比较理想的驱虫药品种之一。辛硫磷对害虫具有较强的杀伤作用，具有环保、成本低、低毒性和高效的原则，如天牛干性害虫等，其防治作用主要来源于对害虫的直接胃毒性、触杀性及黑暗条件下残效长特性[4]。随着辛硫磷在制剂技术的发展与进步，辛硫磷浇泼剂研制成功，规模生产成本降低，辛硫磷在市场上需求量日益增加。辛硫磷浇泼可以通过皮肤渗透给药，渗透药量能够保证驱虫效果，通过皮肤给药途径的药物不需要破坏通过胃肠道的消化液，生物利用度有所提高，同时避免了肝脏首过效应。浇泼剂还具有动物保定容易、给药方便、对动物刺激小等优点，该剂型是草原放牧条件下对群体牛防治寄生虫的理想剂型[5]。

辛硫磷浇泼剂具有杀虫效果好，毒性弱、杀虫范围广、药效持久等特点，对害虫有强触杀及胃毒作用。目前大量研究表明，辛硫磷浇泼剂对于猪疥螨病、牛皮蝇、癞皮病、羊螨病等家畜各种体表外寄生虫病有较好的杀灭和治疗效果。杀灭周围环境的蝇、蚊、虱、蜱、蟑螂、臭虫等[6]。浇泼剂的使用以涂擦、浇注等方式作用于畜体皮肤或采用浸浴的办法，环境杀虫采用喷洒施药。但目前市面上的辛硫磷浇泼剂透皮性能较差，刺激性强，难以有效杀灭寄生在动物皮下的寄生虫。

透皮吸收促进剂是指能够渗透进入皮肤降低药物通过皮肤阻力的材料，可以辅助药物穿过角质层、扩散通过皮肤，由毛细血管进入体循环，达到局部用药全身起效的作用，发挥全身系统治疗作用。目前，市场上新型透皮制剂也很多，如复方左旋咪唑、阿维菌素、伊维菌素、环丙沙星等，对于各类体内及体表的寄生虫均有驱杀效果。为了突破某些动物皮厚毛多的皮肤屏障结构，在兽药的研发过程中透皮吸收促进剂是一种尤为重要的剂型，需要利用目前研究比较先进的微乳技术、脂质体、纳米粒等透皮制剂技术，研发透皮制剂的关键是解决药物的透皮问题。

本研究以辛硫磷为原料药，结合透皮吸收促进剂，制备出高皮肤渗透性辛硫磷浇泼剂，初步评价了其体外透皮效果和临床治疗效果。本研究首先以体外皮肤累计渗透量为指标，采用Franz 扩散池法建立鼠透皮试验模型[7]，运用高效液相色谱法(HPLC) 测定透过液中辛硫磷的含量，评价本公司辛硫磷浇泼剂产品(浴舒嘉) 透皮效果，并与市售普通40%辛硫磷浇泼溶液进行比较，试验结果显示本公司产品浴舒嘉具有良好的透皮效果，且临床药效试验结果显示产品性能更优。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 药品与试剂 辛硫磷标准品(北京德威钠生物技术有限公司)、40%辛硫磷浇泼溶液(商品名为浴舒嘉，批号20040801)、市售普通40%辛硫磷浇泼溶液液(批号2371101)、色谱甲醇，色谱乙腈、异丙醇(天津市康科德科技有限公司)、生理盐水。

1.1.2 试验仪器 TP - 6 智能透皮扩散仪(天津精拓仪器科技有限公司)； 电子天平(FA-1104 型，上海民桥精密科学仪器有限公司)； 高效液相色谱仪(LC -10AD 型，大连依利特分析仪器有限公司)； 超声波清洗仪器(DL-180 型，宁波新芝生物科技股份有限公司)； 高速台式离心机(TGL -16G 型，上海安亭科学仪器厂)； 循环水多用真空泵(西安太康生物科技有限公司)。

1.1.3 试验动物 健康昆明种雄性小鼠20只，体重18 ～24 g (辽宁长生生物技术有限公司)； 母猪80 头，体重50 ～80 kg。

1.1.4 辛硫磷体外高效液相色谱法(HPLC)分析方法学建立

标准曲线的建立: 精密称取辛硫磷对照品，配置质量浓度为0.01，0.025，0.05，0.1，0.25，0.5，1，2.5 和5.0 mg•mL-1的梯度对照品溶液，进行高效液相色谱检测，于260 nm 紫外波长处测定吸光度值(A)，建立质量浓度(C) 与吸光度(A) 的标准曲线。

精密度试验: 精密称取辛硫磷对照品，配制成浓度为0.05，0.5 和5.0 mg•mL-1的梯度溶液，按5 次/d 统计日内误差； 同法1 次/d测定5 d，统计日间误差。

回收率试验: 精密称取辛硫磷对照品，配制成浓度为0.05，0.5 和5.0 mg•mL-1的梯度溶液，每组设置5 个平行组别，进行高效液相色谱检测，于260 nm 紫外波长处测定吸光度值，与标准曲线的计算数值对比统计各梯度浓度回收率平均值及RSD 值。

1.2 试验方法

1.2.1 体外透皮试验

离体鼠皮的制备: 取昆明系小鼠，断颈处死后，立即刮净腹部毛发，剪取腹部皮肤，将取下的皮肤小心去除结缔组织、皮下脂肪层，用生理盐水冲洗，冲洗干净后放置于盛有生理盐水的容器中，放置在4 ℃环境中保存备用，试验前需要自然解冻，并浸泡在生理盐水中0.5 h，解冻后在1 周内进行试验。每次试验前仔细检查鼠皮是否完整，保证不存在任何划痕和破损。

阴性干扰试验: 鼠皮肤固定于扩散池中，并按角质层向上放置。各加入等量的接收液，试验24 h 取出100 μL 接收液更换为等体积的标准品、空白接收液、空白接收液＋标准品[8]以考察接收液对本试验的影响。

体外透皮扩散试验: 采用Franz 扩散池，接收池的有效渗透面积2.58 cm2，将处理好的小鼠皮肤用剪刀剪裁成适合尺寸，置于扩散池与接收池之间，用夹子固定，皮肤的真皮层要与接收液接触，需要将气泡排除，接收液为异丙醇: 生理盐水(50/50，v/v) 17.8 mL，扩散池中分别加入浴舒嘉、市售普通40%辛硫磷浇泼溶液各3 mL，装置恒温水浴中 (37 ±1)℃，磁力搅拌转速为350 r/min，于0.5 h、1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 h 分别取样0.5 mL，并随即补充相同体积、相同温度、相同组成的接收液。各时间点的接收液经微孔滤膜(0.22 μm) 过滤，40 μL 进样，试验重复3 次。计算单位面积的累积渗透量 (Q，mg/cm2)。

式中，Q: 单位面积累积透过量(mg/cm2)；A: 有效经皮吸收面积(cm2)；V: 接收液体积(mL)；V0: 取样体积(mL)；Cn: 为第n个取样点测得的接收液中药物浓度(mg/mL)；Ci为第i(i≤n-1) 个取样点测得的接收液中药物的浓度(mg/mL)。

按下式计算透过百分率Q%:

式中，QT: 供给室加入的总药量； Qt: t时刻的药物累积透过量。

1.2.2 临床药效试验

试验动物分组及试验方法: 将感染猪疥螨的60 头后备母猪随机分为3 组 (A、B、C组)，每组20 头； 把无寄生虫感染的健康后备母猪20 头作为健康空白对照组(D 组)； 各组分栏饲养，详见表1。

表1 试验动物分组

体表寄生虫检查: 在用药前以及治疗后的1、7、14、21、28 d 进行样本采集，从每头猪的四肢及耳郭内侧有明显病变处(每处4 cm2)采集样本。在刮取样本时，先将采样处用纯化水湿润后用钝刀刮，然后收集刮取物。在有水的平皿中分别加入刮取物样本，捣烂并混匀，放置在显微镜下，观察螨虫状态并记录好感染猪头数。疗效观察: 每天观察用药后各组猪的临床症状，并做好结果记录。判断该药物疗效通过计算用药后转阴率: 转阴率＝(用药前阳性猪头数-用药后阳性猪头数) /用药前阳性猪头数×用药前阳性猪头数。

2 结果与分析

2.1 辛硫磷高效液相色谱法(HPLC) 分析方法的建立

2.1.1 色谱条件的确定 十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈一水(70∶30) 为流动相，检测波长为260 nm，流速1 mL/min，进样量40 μL，柱温30 ℃。理论塔板数按辛硫磷峰计算应不低于5 000，辛硫磷主峰与杂质峰的分离度应符合要求[9，10]。

2.1.2 标准曲线的建立 精密称定辛硫磷标准品适量，用乙腈溶解并稀释至10 mg/mL 标准储备溶液。再分别配成浓度为0.01，0.025，0.05，0.1，0.25，0.5，1.0，2.5，5.0 mg/mL 的系列对照品溶液。分别吸取上述溶液40ul 进样，测定，以峰面积为纵坐标(Y)，对照品浓度(mg•mL-1) 为横坐标(X)，按最小二乘法进行线性回归得标准曲线方程y＝10 457x＋294.54，R2＝0.999 8。试验结果表明: 辛硫磷浓度在0.01 ～5.0 mg•mL-1与峰面积呈良好的线性关系。结果详见表2 和图1。

图1 辛硫磷HPLC 标准曲线

表2 辛硫磷HPLC 标准曲线试验结果(n ＝3)

2.1.3 精密度试验 试验所得辛硫磷溶液日内日间精密度结果见表3。本法精密度良好，符合方法学要求。

表3 辛硫磷HPLC 日内日间精密度试验结果(n ＝3)

2.1.4 回收率试验 取 0.05，0.5 和5.0 mg•mL-1的辛硫磷溶液，测定其回收率(n＝3)，根据标准曲线方程，计算浓度及回收率。结果表明，回收率试验符合方法学要求。试验结果见表4。

表4 辛硫磷HPLC 回收率试验结果(n ＝3)

2.2 体外透皮试验结果

2.2.1 阴性干扰试验 结果表明，在空白接收液辛硫磷出峰位置无干扰峰，分析条件可行，相关色谱图见图2。

图2 体外透皮试验接收液HPLC 色谱

2.2.2 体外透皮试验结果 根据方法1.2.1.3计算，浴舒嘉、市售普通40%辛硫磷浇泼溶液两个产品在0.5、1、2、4、6、8、12、24 h 的累积透过量及透过率，结果见表5、表6。

表5 浴舒嘉体外透皮试验结果(n ＝6)

表6 市售普通40%辛硫磷浇泼溶液体外透皮试验结果(n ＝6)

应用Franz 扩散池法对比40%辛硫磷浇泼溶液(浴舒嘉)、市售普通40%辛硫磷浇泼溶液的体外透皮效果表明，由两种辛硫磷浇泼剂皮肤累积渗透量数据(表5、表6) 和累积渗透曲线(图3) 可知，本公司40%辛硫磷浇泼溶液产品(浴舒嘉) 24h 皮肤累积透过量是市售普通40%辛硫磷浇泼溶液的累积透过量的95 倍，表明本公司产品40%辛硫磷浇泼溶液(浴舒嘉) 透皮性能明显优于市售普通40%辛硫磷浇泼溶液。

图3 40%辛硫磷浇泼透皮制剂体外皮肤累积渗透量曲线

2.3 临床药效试验

2.3.1 临床观察 试验期间，各试验组母猪未出现中毒、过敏等毒副反应症状，各试验组母猪采食饮水、精神状态、排便、给药部位均正常。

2.3.2 试验结果 试验结果显示，使用40%辛硫磷浇泼溶液(浴舒嘉) 试验组驱虫后第28 d，试验猪体表寄生虫转阴率为100%，使用市售普通40%辛硫磷浇泼溶液试验组在驱虫后28 d，试验猪体表寄生虫转阴率为75%，表明浴舒嘉对猪疥螨感染具有良好的疗效，且其效果优于市售普通40%辛硫磷浇泼溶液。治疗14 d 后，治愈率可达到85%，21 d 治愈率100%。详见表7。

表7 各试验组体表寄生虫检查结果

3 结论

从本试验结果看，40%辛硫磷浇泼溶液经皮肤外用给药，渗透到皮下组织的药量能够保证驱虫效果，经皮肤涂抹和喷洒给药途径，药物不需要通过胃肠道消化液的破坏，不经过口腔黏膜吸收对黏膜的损害，通过试验测定回收率和透过率，显示辛硫磷浇泼溶液有提高药物的生物利用度的作用，也避免了肝脏首过效应，降低药物的不良反应发生率，尤其是规模化养殖和群体饲养家畜在防治寄生虫疾病上的首选药剂。2000 年以来，透皮给药制剂技术研究的迅速发展，突破了传统体外经皮渗透给药的观念，以皮肤作为媒介，在产品研究开发过程中加入适当的透皮吸收促进剂，能够辅助药物穿过角质层、促进通过批复扩散，由毛细血管将药物输入体内进入体循环，使药物发挥治疗的作用。目前，外用药剂经透皮给药普遍存在疗效差的问题，主要问题是通过透皮给药途径，批复对药物透析的效果不明显，药物吸收的生物利用度差等原因导致，这也是经皮外用给药系统研究技术的关键。本公司开发的40%辛硫磷浇泼溶液(浴舒嘉)，通过体外透皮试验方法评价，其透皮性能明显提高，对猪疥螨感染具有良好的疗效，治疗14 d 后，治愈率可达到85%，21 d 治愈率100%，且优于市售普通40%辛硫磷浇泼溶液； 并通过临床药效试验证明浴舒嘉可发挥高效的驱虫作用，对治疗猪疥螨等体外寄生虫感染具有广阔应用前景。