环状RNA的表达在非小细胞肺癌细胞中的作用及机制研究

刘国华

齐齐哈尔医学院附属第三医院呼吸二科，黑龙江齐齐哈尔 161000

肺癌是临床常见的呼吸系统恶性肿瘤，非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）是其主要病理类型，由于缺乏早期诊断，约75%的患者发现时已处于中晚期，5年生存率很低[1-3]。因此，有必要对NSCLC发生发展的分子机制有更全面的认识，以寻找可靠有效的治疗靶点和早期生物标志物。CircRNA是一种新发现的非编码环状RNA，在细胞中广泛表达，并具有基因调控的作用[4-5]。有研究证实CircRNAs在肿瘤的发生发展过程中，通过miRNA来调控基因的表达[6-8]。基于此，本研究的目的旨在探究CircRNA NFIX在NSCLC的作用及其分子机制。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

肺泡上皮细胞BEAS-2B购自上海ATCC细胞库，阳离子脂质体2000均购自GIBCO公司，载体均由金斯瑞公司合成。CCK-8试剂购自DOJINDO，细胞凋亡试剂盒购自BD公司，Trizol试剂及逆转录试剂盒购自invitrogen公司，抗体均购自Abcam公司。

1.2 方法

使用完全培养基（DMEM+10%FBS）培养A549细胞，以2×105个/mL密度接种24孔板中，37℃，5%CO2，参照Lipofectamine 2000试剂说明书将pLCDH-CircRNA NFIX、pLCDH、si-CircRNA NFIX、si-control、pLCDH-CircRNA NFIX +miR-132-3p mimics、pLCDH-CircRNA NFIX +miR-control、miR-132-3p mimics、miR- control分别通过转染至A549细胞，分别命名为pLCDH-CircRNA NFIX组（A组）、pLCDH组（A-对照组），si-CircRNA NFIX 组（B组）、si-control组（B-对照组）、pLCDH-CircRNA NFIX+miR-132-3p mimics组（C组）、pLCDH-CircRNA NFIX +miR- control组（C-对照组），每组设置9个复孔，24 h后收集待用。

1.3 观察指标

①LncRNA RMRP的表达：提取细胞总RNA，逆转录cDNA并作为PCR的模板，以荧光定量PCR试剂盒进行PCR扩增，计算LncRNA RMRP的相对量。②细胞增殖率及凋亡率：CCK-8检测细胞增殖率，流式细胞仪检测细胞凋亡率。③炎症因子：按照ELISA检测试剂盒说明书检测白细胞介素-1β（interleukin-1β, IL-1β）、白细胞介素-6（interleukin-6,IL-6）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）的表达水平。④蛋白表达：Western blot检测Bcl-2、Bax、Caspase-3及cleaved Caspase-3蛋白表达。

1.4 统计方法

采用SPSS 22.0统计学软件对数据进行处理，符合正态分布的计量资料用（±s）表示，行t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CircRNA NFIX对非小细胞肺癌细胞A549的作用

与对照组相比，A组CircRNA NFIX过表达，细胞存活率、Bcl-2、IGF1R表达显著升高，细胞凋亡率、Bax、cleaved Caspase-3蛋白表达显著降低，B组CircRNA NFIX沉默表达，细胞存活率、Bcl-2、IGF1R蛋白表达显著降低，细胞凋亡率、Bax、cleaved Caspase-3蛋白表达显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1、图1。

图1 各组细胞Bcl-2、Bax、Caspase-3及cleaved Caspase-3蛋白表达

表1 CircRNA NFIX对非小细胞肺癌细胞A549增值及凋亡的影响(±s)

表1 CircRNA NFIX对非小细胞肺癌细胞A549增值及凋亡的影响(±s)

注：与A-对照组和对照组相比较，*P＜0.05；与B-对照组和对照组相比较，#P＜0.05。

组别对照组（n=9）A-对照组（n=9）A组（n=9）B-对照组（n=9）B组（n=9）CircRNA NFIX 1.00±0.12 1.01±0.11（2.12±0.24）*1.01±0.13（0.41±0.04）#细胞凋亡率（×10-2）4.25±0.45 4.28±0.44（3.14±0.01）*4.19±0.41（8.31±0.96）#细胞存活率（×10-2）96.24±1.25 95.87±1.24（100.58±1.57）*95.38±1.26（83.54±1.15）#IGF1R 1.02±0.44 1.00±0.46（2.88±1.41）*1.01±0.44（0.48±0.06）#

2.2 CircRNA NFIX靶向miR-132-3p对非小细胞肺癌细胞A549的作用

与C-对照组相比较，C组细胞存活率、Bcl-2、IGF1R蛋白表达显著降低，细胞凋亡率、Bax、cleaved Caspase-3蛋白表达显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2、图1。

表2 CircRNA NFIX靶向miR-132-3p对非小细胞肺癌细胞A549增值及凋亡的影响(±s)

表2 CircRNA NFIX靶向miR-132-3p对非小细胞肺癌细胞A549增值及凋亡的影响(±s)

组别C组（n=9）C-对照组（n=9）t值P值miR-132-3p 1.01±0.10 0.39±0.05 16.636＜0.001细胞凋亡率（×10-2）4.59±0.76 3.10±0.30 5.471＜0.001细胞存活率（×10-2）95.11±1.21 100.96±1.57 8.854＜0.001 IGF1R 1.01±0.45 2.82±1.35 3.816 0.002

3 讨论

CircRNA具有多种生物学功能，同样也参与肿瘤的发生和发展，如Circ-AGFG1通过“海绵”miR-195-5p调节CCNE1的表达，促进三阴乳腺癌的进展[9-10]。在肝细胞中，has_circ_0078710作为miR-31海绵作用促进细胞增殖、迁移、侵袭和肿瘤生长[11-12]。CircRNA NFIX是CircRNA的一种，被证明与心肌再生有关[13-14]。CircRNA NFIX同样也参与肿瘤的发生和发展，CircRNA NFIX通过Notch信号通路调控miR-34a-5p促进胶质瘤进展[15-17]。Xu H等[18]的研究指出，circNFIX是唯一在胶质瘤中过表达的circRNA，流式细胞仪检测显示，与NC相比，si-circNFIX可以促进细胞凋亡。同样，miR-34a-5p可以减轻si-circNFIX的抑制作用（P＜0.05）。CCK8检测结果表明sicircNFIX抑制细胞增殖，而miR-34a-5p抑制剂促进细胞增殖，至今，CircRNA NFIX在NSCLC中作用尚未被探究，本研究首先选择非小细胞肺癌细胞株A549，过表达CircRNA NFIX可以显著抑制细胞凋亡，促进肺癌细胞体外增殖，而采用si-RNA干扰技术沉默CircRNA NFIX表达可以显著促进细胞凋亡，抑制肺癌细胞体外增殖，故可证实CircRNA NFIX在非小细胞肺癌中扮演癌基因的作用，并研究miR-132-3p与CircRNA NFIX过表达对A549细胞的增殖和凋亡影响，结果发现过表达miR-132-3p可以抑制CircRNA NFIX对A549细胞的促增殖作用，进一步证实CircRNA通过海绵结合miR-132-3p发挥对肿瘤细胞的作用，通过对不同组转染细胞中IGF1R表达量检测发现，CircRNA NFIX通过海绵结合miR-132-3p，进一步调节基因IGF1R起作用。

综上所述，环状RNA CircNFIX在非小细胞肺癌中发挥重要的作用，RNA CircNFIX有望成为非小细胞肺癌靶向治疗的新靶点。