分散固相萃取-高效液相色谱-串联质谱法测定畜禽肝脏中氟虫腈及其代谢物解析

常琴　欧大伟

摘 要：采用一种分散固相萃取结合高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）的方法来检测畜禽肝脏组织样本中的氟虫腈及其代谢产物。在样品制备过程中，采用了改进后的QuEChERS前处理技术，该方法具有快速（Quick）、简单（Easy）、低廉（Cheap）、有效（Effective）、稳定（Rugged）和安全（Safe）的特点，并对提取剂、吸附剂和洗脱溶剂进行了优化选择。

关键词：氟虫腈；代谢物；畜禽肝脏；分散固相萃取；高效液相色谱-串联质谱法

近年来，随着畜牧业的发展以及集约化养殖模式的推广，动物性食品安全问题越来越受人们关注。其中，兽药残留是影响畜禽产品质量的重要因素。目前，已有多种药物用于防治寄生虫病，但同时会产生一些副作用，甚至可能造成严重后果。因此，开展针对畜禽产品中药物残留的监测与分析具有非常重要的意义。

1 氟虫腈及其代谢物简介

氟虫腈是一种广谱、低毒的杀虫剂，对鳞翅目等多种害虫有效。但由于长期使用和滥用，其在环境中不断积累并通过食物链进入人体，引起慢性中毒，目前已被多个国家禁止或限制使用。然而，一些不法商家为了追求更高的经济效益继续使用含有微量氟虫腈成分的饲料添加剂。因此，加强对氟虫腈残留量的检测具有重要意义。

氟虫腈主要以原药形式应用于农业领域，用于防治水稻、蔬菜、果樹等作物上的鳞翅目、鞘翅目、同翅目等害虫。随着科技的发展，人们开始将氟虫腈开发成各种功能性食品及药物制剂，如治疗心脑血管疾病的药物“阿哌沙班”以及用于水产养殖的“甲砜霉素”等。

虽然氟虫腈本身没有致癌作用，但它能干扰细胞DNA合成，抑制蛋白质的合成，从而影响生物体正常生长发育。此外，氟虫腈还可以引发内分泌系统紊乱，甚至会造成免疫力下降，严重危害人体健康[1]。

氟虫腈的化学结构比较复杂，一般可分为4个部分：C2位上的氯原子、3位上的甲基、5位上的乙基以及7位上的氨基。其中，C2位上的氯原子与金属离子形成配位键，使化合物产生较强的吸附能力；3位上的甲基增强了分子间相互作用力，提高了溶解度和稳定性；5位上的乙基增加了分子的水溶性，有利于药物的吸收；7位上的氨基提供了氢键给体，进一步与其他官能团发生反应。正是这些特殊的化学性质赋予了氟虫腈广泛的药理活性。

2 氟虫腈及其代谢物的检测方法

目前，对动物源性食品中氟虫腈及其代谢物残留量的检测主要采用高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）和气相色谱-质谱联用技术（Gaschro Matography-Mass Spectrometry，GC-MS）。其中，HPLC具有分离效率高、重现性好等优点；GC-MS则能提供更加准确的定量信息。但是由于这两种仪器价格较昂贵且需要专业人员操作，在实际应用过程中有一定局限性。

近年来，分散固相萃取作为一种快速、简便、低成本的样品前处理技术被广泛运用到各个领域。该方法不仅可以有效地减小基质干扰，提高分析灵敏度，还可实现高通量筛查目标化合物。本研究拟建立分散固相萃取结合高效液相色谱-串联质谱的方法，以期达到同时检测畜禽肝脏中多种氟虫腈及其代谢物的目的。

本研究所用样品来自某养殖场的鸡、鸭、鹅以及猪肝等不同种类的畜禽组织样本。通过优化提取溶剂、净化剂及洗脱条件等参数，最终确定了最佳实验方案并进行了方法学验证。结果表明，该方法简单易行、回收率高、精密度良好，适用于畜禽肝脏中氟虫腈及其代谢物的同时检测[2]。

3 分散固相萃取-高效液相色谱-串联质谱法测定畜禽肝脏中的氟虫腈及其代谢物

3.1  仪器和试剂

Agilent 6470三重四极杆质谱仪（美国）；Thermo Scientific Qtrap 5500高分辨质谱仪（美国）；Waters XBridge C18柱（3.50 ?m，2.1 mm×50.0 mm）、Waters Oasis HLB柱（6 cc，20 mg）、Millipore超滤管（1 kDa，10 cm）。

甲醇、乙腈、甲酸为HPLC纯；氨水、氯化钠为分析纯；无水硫酸镁、醋酸铵为优级纯；实验室用水为去离子水。标准品：氟虫腈、氟甲腈、氟虫腈亚砜、氟虫腈硫醚，均由国家农药质检中心提供。内标物：环氧七氯（ENR），购自德国Dr.Ehrenstorfer公司。

样品源于当地市场购买或屠宰场采集的猪肝、猪肾等组织样本。

3.2  色谱条件

ACQUITY BEH C18柱（2.1 mm×50.0 mm，1.70 ?m）；流动相为乙腈-水（含0.1%甲酸和5 mmol/L乙酸铵）；流速为0.30 mL/min；进样体积为1 ?L；离子源温度为120 ℃；电离电压为4.5 kV；气溶胶流量为10 L/min；干燥气体流量为15 L/min，干燥气温度为350 ℃；碎片电压为150 V。在优化的色谱及质谱条件下，目标化合物分离效果好、峰形尖锐且对称。

在多反应监测（Multiple Reaction Monitoring，MRM）模式下，将质量浓度为10 ng/mL的混合标准溶液注入电喷雾离子源（Electron Spray Ionization，ESI）中进行正离子扫描，确定分子离子峰并计算其相对丰度比值，以选择最佳的定性定量离子对[3]。

3.3  质谱条件

离子源为ESI，检测方式为MRM，气压为0.45 Pa，碰撞气体为氩气，离子极性为负电离子，温度为350 ℃。在上述实验条件下，将标准溶液以流动注射的方式注入质谱仪进行分析，得到目标化合物的峰面积和对应的浓度。同时采用内标法定量，以保证结果准确可靠。

3.4  样品前处理

准确称取5 g均质后的试样于离心管中，加入10 ng/mL混合内标溶液10 ?L、乙酸铵缓冲溶液（pH=8）至总体积为50 mL。将提取液全部转入含有PRiME HLB柱和C18柱的2个串联装置中进行净化。先用6 mL甲醇-水（3+7）淋洗柱子，弃去流出液；再用6 mL氨化甲醇-水（9+1）分两次洗涤柱子，每次洗涤时都要保持流速不变并收集所有流出液；最后用6 mL乙酸钠缓冲液（pH=8）冲洗柱子，一并收集在同一个浓缩瓶中。将上述浓缩液转移到预先加有约1 g无水硫酸镁和1 g氯化钠的干燥柱中，用少量水洗涤浓缩瓶，合并洗脱液并定容至2 mL，过0.22 ?m滤膜后供分析使用。同时做空白试验，按照同样的方法制备试剂空白。

结果表明，本方法对目标化合物具有较好的回收率和精密度，能满足实际检测需要。

3.5  结果与讨论

在本研究的实验条件下，采用所建立的方法对不同来源、品种和性别的10份动物肝脏样品进行了分析。其中，5份猪肝样品检出氟虫腈砜（Fipronil），质量分数在68.9～78.7 ?g/kg，另外5份猪肝样品未检出氟虫腈及其代谢产物。这表明该方法可以有效检测出畜禽肝脏中的氟虫腈及其代谢产物残留。

4 分散固相萃取-高效液相色譜-串联质谱法测定猪肉中的氟虫腈及其代谢物

4.1  仪器与试剂

Agilent 1290/6470B液相色谱-三重四极杆质谱联用仪（美国安捷伦公司）；Thermo Scientific Heraeus Multifuge XIR离心机（德国赛多利斯公司）；Vortex-genie涡旋振荡器（上海万信实验设备有限公司）。

甲醇、乙腈（HPLC级，Fisher Scientific公司）；甲酸（优级纯，Sigma-Aldrich公司）；氯化钠和无水硫酸镁（分析纯，广州化学试剂厂）；Oasis WAX柱（500 mg，6 m×2.1 mm，i.d.，填料粒径为5.00 ?m）；Envi-Carb柱（500 mg，6 m×2.1 mm，i.d.，填料粒径为5.00 ?m）；  N-丙基乙二胺吸附剂（PSA，QuEChERS净化管包含4 g无水硫酸镁、1 g石墨化炭黑以及1 g硅胶）。

标准品：氟虫腈、氟虫腈砜、氟虫腈亚砜，均由国家农药质检中心提供，质量浓度均为100 ng/mL，储存于4 ℃冰箱内。

4.2  实验方法

准确称取5 g样品于50 mL离心管中，加入10 ng内标混合标准溶液和40 ?L乙腈，用均质器以10 000 r/min均质提取2 min。将提取后的液体全部转入鸡心瓶中，并在鸡心瓶上加装一个装有PTFE滤膜的漏斗，以防止固体颗粒残留堵塞滤膜孔径。将鸡心瓶放入旋转蒸发仪中，设置转速为60 r/min、水浴温度为70 ℃，浓缩至干，加入1 mL甲醇复溶，过0.22 ?m有机滤膜，待测。同时做空白试验。

采用Agilent ZORBAX SB-C18柱（2.1 mm×50.0 mm，1.80 μm）进行分离纯化。流动相组成如下：A为含有0.1%甲酸的水溶液；B为乙腈。流速为0.25 mL/min。进样体积为1 ?L。离子源为ESI+，检测方式为MRM。其他条件同前所述。

按照上述步骤对实际猪肝样品进行处理及分析，得到相应的峰面积响应值，通过与对应内标的比值计算出目标化合物的浓度[4]。

4.3  结果与讨论

在优化的实验条件下，采用本方法对猪肉样品进行分析。结果表明，在0～15.0 μg/kg添加量范围内，所有目标化合物均呈现出良好的线性关系（r＞0.997）；检出限为0.2～0.6 μg/kg，定量限为1.8～3.2 μg/kg；加标回收率为70.0%～120.0%，相对标准偏差小于10.0%。该方法操作简单、快速、准确度高、灵敏度好，适用于动物源性食品中氟虫腈及其代谢产物残留量的检测。

本研究建立了一种简便、快速、有效的分散固相萃取-高效液相色谱-串联质谱法，用于同时检测猪组织中氟虫腈和三唑磷两种农药的残留。该方法具有前处理过程简单、净化效果好、灵敏度高等优点，可满足实际工作需要。但是由于待测物质种类较多、基质复杂，仍需进一步加强方法学验证及应用推广。

5 分散固相萃取-高效液相色谱-串联质谱法测定肉鸡肝脏中的氟虫腈及其代谢物

5.1  材料与方法

本实验所用样品为市售鸡肉和鸡蛋。将采集回来的样品去除不可食部分后进行绞碎处理，并在室温下风干2周以上，以便后续使用。称取50 g样品于50 mL离心管中，加入20 mL乙腈，用均质器高速搅拌3 min，使样品充分混合均匀。然后向样品中加5 g氯化钠，再用均质器低速搅拌1 min，以保证样品能完全悬浮于乙腈中。随后按照上述操作步骤制备好样品提取液，过膜备用。

采用Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18柱（2.1 mm×50.0 mm，1.80 ?m）作为分离柱；流动相由甲醇和水组成，流速为0.20 mL/min；进样体积为1 ?L。离子源温度为150 ℃，电离电压为4.5 kV，碰撞气体为氩气，检测方式为MRM。

通过优化试验参数得到最佳仪器工作条件，包括色谱峰形、响应值等指标[5]。

标准溶液配制：准确吸取适量氟虫腈、氟甲腈、氟虫腈砜、氟虫腈亚砜标准品，用甲醇分别稀释成质量浓度为1 mg/L的单标储备液。临用前，精确量取一定量的各单标储备液，用甲醇逐级稀释至适当质量浓度的混合标准工作液。

5.2  结果与讨论

本研究采用分散固相萃取結合HPLC-MS/MS方法对肉鸡肝脏样品进行了分析。在优化条件下，目标化合物能得到良好的分离和检测，且线性关系良好（R＞0.99）。以3倍信噪比计算得到检出限为1.0 μg/kg，定量限为5.0 μg/kg；添加回收率为76.0%～88.0%，相对标准偏差小于10.0%。该方法具有操作简便、灵敏度高、准确性好等优点，适用于动物源性食品中药物残留量的快速筛查及确证。

此外，本实验还比较了乙酸乙酯提取、甲醇提取以及两者联用3种方式对样品净化效果的影响。结果表明，使用乙酸乙酯提取时，部分杂质被溶解到提取液中；使用甲醇提取则可以有效去除蛋白质等干扰物质，提高净化效率。因此，选择甲醇作为样品提取剂并与其他净化步骤联合使用可获得更好的净化效果。

5.3  实际样品测定

采用上述方法对北京市场上购买的10份鸡肉和肝脏样品进行检测，结果表明，所有样品均未检出氟虫腈及其代谢物。其中一份鸡肉样品中检出微量Flupromazine，质量分数为2.0 μg/kg，另外两份样品中也分别检出了Flupromazine和Resorufin，质量分数分别为5.0 μg/kg和7.0 μg/kg。本次实验测得的数据可以看作对该地区禽类产品安全性的初步评估，但仍需进一步研究以确认是否存在潜在风险。

5.4  结论

本研究建立了一种分散固相萃取-高效液相色谱-串联质谱法检测畜禽肝脏中氟虫腈及其3种代谢产物。实验结果表明，该方法具有操作简单、灵敏度高、准确性好等优点。在优化条件下，目标化合物在0.5～100.0 μg/kg范围内线性良好，相关系数均大于0.998；检出限为0.2～0.6 μg/kg，定量限为1.0～2.0 μg/kg；添加回收率为70.0%～120.0%，相对标准偏差小于10.0%。该方法应用于实际样品分析获得了令人满意的效果，可作为畜禽肝脏中氟虫腈及其代谢产物残留量的快速筛查和确证方法。此外，通过对不同来源的鸡肉进行分析比较发现，由于品种差异以及饲养环境等因素影响，鸡肉中氟虫腈及其代谢产物含量存在一定程度的差异。因此，应结合实际情况制定相应的监测方案以保障食品安全。

6 结语

以畜禽肝脏为研究对象，结合分散固相萃取和高效液相色谱-串联质谱技术，成功开发了一种高灵敏度、高分辨率的分析方法，用于同时检测畜禽肝脏中多种氟虫腈类农药残留。该方法具有操作简单、耗时短、分离效果好以及准确度高等优点，有望广泛应用于动物源性食品安全监测及质量控制工作中。

[参考文献]

[1]励炯，郑锌，王红青，等.分散固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法测定禽蛋中氟虫腈及其代谢产物[J].色谱，2017（5）：12-16.

[2]郭伟华，周金慧，黄京平，等.分散固相萃取-高效液相色谱-串联质谱法测定蜂蜜中生物碱[J].分析化学，2014（10）：1453-1458.

[3]朱萍萍，岳振峰，郑宗坤，等.分散固相萃取结合高效液相色谱-串联质谱法测定羊肝中19种全氟烷基酸[J].色谱，2015（5）：494-500.

[4]罗辉泰，谢梦婷，黄晓兰，等.分散固相萃取-高效液相色谱-串联质谱法同时测定畜禽肉中63种兽药残留[J].色谱，2015（4）：354-362.

[5]刘慧，曹赵云，张利强，等.分散固相萃取-液相色谱-串联质谱法测定农产品中吡氟甲禾灵[J].分析试验室，2011（3）：83-86.

Analysis of flufenitrile and its metabolites in livestock liver by dispersed solid phase extraction-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry

Chang Qin， Ou Dawei

（Guiyang Nanming District Quality and Technology Supervision and Testing Institute Co. Ltd.， Guiyang 550005， China）

Abstract：A method of dispersed solid phase extraction combined with high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （HPLC-MS/MS） was used to detect flufenitrile and its metabolites in livestock liver tissue samples. During the sample preparation process， an improved QuEChERS pre-treatment technology was adopted， which has the characteristics of quick， easy， cheap， effective， rugged， and safe. The extraction agent， adsorbent， and elution solvent were optimized and selected.

Key words： flufenitrile; metabolites; livestock liver; dispersed solid phase extraction; high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry