基于亲水型低共熔溶剂的分散液液微萃取技术测定茶叶中的农药多残留

陈文辉 王华威 李建勋 谭海广 李倩倩 杨术鹏杜丽平，* 李 熠，*

（1天津科技大学生物工程学院，天津 300457；2中国农业科学院农产品加工研究所，北京 100193）

我国作为茶叶生产和出口大国，输出的茶叶种类和产量稳居世界前列［1］。为提高茶叶的产量和质量，减少病虫害威胁，茶叶生产过程中通常会使用农药，因此茶叶中的农残含量是否超标受到消费者的重点关注［2］。许多国家和组织，例如美国、日本、欧盟对茶叶中各种农药的最大残留限量值（maximum residue limit，MRL）要求日趋严格［3］。因此，开发茶叶中农药残留的快速检测方法已成为研究热点。常用的茶叶中农药残留前处理技术主要有固相萃取技术［4-5］、固相微萃取技术［6-7］、液相微萃取技术［8-9］、QuEChERS（quick、easy、cheap、effective、rugged、safe）［10-11］等。目前这些技术已经十分完备，但为追求更高的灵敏度和微量化发展，萃取技术仍在不断发展［12］。

低共熔溶剂（deep eutectic solvent，DES）主要是指由氢键受体和氢键供体以一定物质的量配比形成的两相或三相混合溶液［13］。相较于物理性质相似的离子液体，DES在生物基质内的萃取效果更好，且对目标物损伤少，制备成本也较低，所以近年来研究者们逐渐使用相似的DES来代替离子液体［14-15］。DES相较于离子液体而言，除了具备离子液体的优良物理特性，还具有可回收利用、可生物降解、原子利用率高和生物相容性好等特点［16-19］，已成为近年来研究的热点。目前研究多采用疏水性DES 对液体中的目标物提取富集，但对于茶叶等复杂固体基质，疏水性DES 在分液后多存留于体系底部，不便于采集［20］，而采用亲水型DES（hydrophilic deep eutectic solvent，HP-DES）提取样品中的目标物时，可通过加入适量乳化剂诱导调节HPDES相密度，分液后可在体系顶部分层，故可尝试进行方法优化后用于茶叶中农药残留的萃取。

本研究以氯化胆碱（choline chloride，ChCl）为氢键受体（hydrogen-bonding acceptor，HBA），六氟异丙醇（hexafluoroi-sopropanol，HFIP）为氢键供体（hydrogenbonding donor，HBD），通过加热兼磁力搅拌合成了一种HP-DES，将其作为萃取剂，通过分散液液微萃取法（dispersed liquid-liquid microextraction，DLLME）对茶叶中的农药多残留进行萃取，结合高效液相质谱-串联质谱（high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）对目标物进行检测，并对前处理条件和分析方法进行全面优化，旨在探究方便快捷、萃取效率高、有机试剂用量少的农药残留前处理技术，为保障茶叶食用和出口安全提供新的研究方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

农药标准品：65种农残标品，见电子附表1（纯度≥95%），中国标准物质有限公司；六氟异丙醇（HFIP，纯度99%）、氯化胆碱（ChCl，纯度99%），上海源叶生物科技有限公司；乙腈、甲醇（色谱纯），美国Thermo Fisher公司。

电子附表1 65种农药的动态多反应监测参数Electronic Schedule 1 The DMRM parameters of 65 pesticides

电子附表1（续）

本研究选取金骏眉红茶（福建省泉州市）作为代表茶样。

1.2 仪器与设备

Agilent 1290-6495高效液相色谱-串联质谱仪，美国Agilent 公司；MiliQ Synergy 超纯水系统，美国Millipore 公司；VX-III 多管涡旋振荡器，北京踏锦科技有限公司；HQ-60-IV 涡旋混合器，北方同正科技有限公司；JC-FW-100 粉碎机，青岛聚创环保集团有限公司；BSA 124S 电子天平，德国Sartorius 有限公司；MSHPro+磁力搅拌器，北京大龙仪器有限公司；H1850台式高速离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 标准溶液配制 单一标准储备液：将1 000 mg·L-1的农药标准物质用甲醇分别稀释至100 mg·L-1，在-20 ℃下避光保存备用。混合标准储备液：分别从每个单一标准农药储备液中吸取一定量置于同一个10.00 mL 容量瓶中，用甲醇定容，配制成1 mg·L-1的混合标准储备液，于-20 ℃下避光保存备用。

1.3.2 样品前处理 将红茶样品用粉碎机粉碎成茶叶粉末，过16 目筛，置于干燥容器内保存，待后续试验使用。

1.3.3 亲水型低共熔溶剂（HP-DES）的制备 以ChCl为氢键受体，HFIP为氢键供体，按照ChCl与HFIP物质的量配比为1∶2 合成HP-DES，其物理性质见表1。通过加热法制备HP-DES［21］，将ChCl 与HFIP 置于10 mL 的圆底烧瓶中，加入磁转子，将圆底烧瓶置于磁力搅拌器上80 ℃水浴恒温加热，磁转子进行均匀搅拌，直至形成透明均一的液体，将制备的HP-DES 放置在-20 ℃下进行密封保存，若静置后24 h 仍保持澄清透明状，未出现沉淀或凝胶，则合成的HP-DES 稳定可使用［22］。

表1 HP-DES的物理性质Table 1 Physical properties of HP-DES

1.3.4 基于亲水型低共熔溶剂（HP-DES）的分散液液微萃取（DLLME）程序 精确称取0.50 g 红茶茶粉置于15 mL离心管中，准确加入200 μL的HP-DES作为萃取剂和5 mL超纯水进行混合，再加入2 mL的乙腈作为乳化剂，初步形成浑浊乳化液。将混合物涡旋震荡大约10 min 进行提取，再以6 000 r·min-1离心6 min。离心后，整体呈液-液-固三相混合体系，水相处于中间相，而茶叶基质和杂质位于底部相，HP-DES 相则位于顶部，便于提取。记录体积后，用注射器收集HPDES相溶液，过0.22 μm滤膜后进行分析检测。

1.3.5 色谱条件 色谱柱：ACQUITY UPLC®BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm），美国Waters 公司。流动相：0.1%甲酸-水溶液（A）和乙腈（B），流动相梯度洗脱程序：0～3 min，1%～30% B；3～6 min，30～40% B；6～9 min，40% B；9～15 min，40%～60% B；15～19 min，60～99% B；19～23 min，99% B；25 min，1% B。柱 温 为35 ℃，流动相的流速为0.3 mL·min-1，进样量为5 μL。

1.3.6 质谱条件 电喷雾离子源（electron spray ionization， ESI），采用动态多反应监测模式（dynamic multiple reaction monitoring，DMRM）；喷嘴电压2 000 V；离子源温度：280 ℃；干燥气流速：12 L·min-1；雾化器压力：30 psi；鞘气温度：350 ℃；鞘气流速：10 L·min-1；目标物的信息及质谱参数见电子附表1。

1.3.7 方法学考察及基质效应评价 取不含待测药物的茶叶空白基质，用其稀释混合标准储备液配制成1、2、5、10、20、50、100、200、500 μg·L-1系列标准工作液。以各个农药目标物的定量离子峰面积为纵坐标（y），其质量浓度为横坐标（x，ng·mL-1），考察65种农药的线性关系；定量限（limit of quantitation，LOQ）检测采用10 倍信噪比（signal-noise ratio，S/N）计算。在0.5 g茶粉中添加10、50、100 μg·L-13 个浓度水平的农药混合标准溶液进行添加回收试验，每个浓度水平设置6组平行。通过计算3个添加水平下样品的加标回收率和相对标准偏差（relative standard deviation， RSD）来反映建立方法的准确度和精密度；65种农药的基质效应（matrix effect，ME）通过100 μg·kg-1下基质匹配标准溶液与标准溶液中对应峰面积之比得出。具体计算公式为：

ME值为正值表示基质增强效应，负值表示基质抑制效应，且根据ME 值大小可分为3 类：当|ME|=0%～20%时定义为弱基质效应；当|ME|=20%～50%时定义为中等基质效应；当|ME|＞50%时定义为强基质效应［24］。

1.4 数据分析

使用安捷伦B.07 定性和B.07 定量工作软件对定性定量数据进行处理；通过Excel 2016 软件对萃取条件优化与方法学验证的相关数据进行统计分析，并使用Origin 2019软件作图。

2 结果与分析

2.1 质谱条件的优化

根据欧盟对于农药定性确证的要求，一般需要4 个定性确证点［25］，因此本试验对每个农药都选择了1 个母离子和2 个子离子，满足定性要求。将2 个子离子中丰度高的作为定量离子，并对碰撞能量进行相应优化，确定最佳质谱参数。65 种农药的质谱参数见表2。

表2 本方法与其他方法的对比Table 2 Comparison between the method in this paper and the other methods

2.2 前处理方法的优化

2.2.1 萃取剂种类 DES合成配比的选择对于目标物的萃取效果尤为重要。以ChCl 为HBA，HFIP 为HBD，按照ChCl和HFIP 物质的量配比为1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、2∶1 合成5 种HP-DES（DES-1～5），以平均回收率为评价标准进行优化选取。结果显示，DES-1、DES-5 的黏度较大，合成DES 后有絮状物生成，会发生严重的沉淀现象，无法作为萃取剂使用；DES-2、DES-3、DES-4合成后均为澄清状，且在储存过程中保持澄清均一的溶剂形态，无沉淀现象发生，将这3 种HP-DES 作为萃取剂加入乳化剂能够实现三相分离，达到快速萃取的效果。以每类农药的平均回收率为评价指标，DES-2萃取效果最佳（图1），可能是因为DES-2 合成后，氢键作用力强、黏度较低，更易分散于溶液之中，从而提高了萃取效率［30］。因此以ChCl和HFIP 的物质的量配比为1∶2制成的HP-DES进行后续试验。

图1 萃取剂种类对萃取效果的影响Fig.1 Effects of type of extractant on extraction

2.2.2 萃取剂体积 确定HP-DES 的配比后，进一步考查HP-DES 用量（100、200、300、400 μL）对茶叶中各类农药平均回收率的影响。HP-DES 用量尽可能少，以达到浓缩富集目标物的效果［31］。由图2 可知，当HP-DES 用量从100 μL 提升到200 μL 时，各类农药的平均回收率提升15.56～28.00 个百分点，这是由于HP-DES 用量增加使目标物在HP-DES 中的溶解度逐渐增加，萃取效果得到提升；继续增加HP-DES用量，各类农药平均回收率总体呈现下降趋势，且用量到达400 μL时，各类农药平均回收率下降趋势明显，可能是因为HP-DES 用量在200～400 μL 范围内时，HP-DES的黏度增大，传质效率逐渐开始下降，导致部分目标物残留在水相中，而HP-DES体积的增加导致部分水相进入HP-DES 相，使得其中目标物的浓度减少，因而导致回收率下降［32］。因此选择200 μL作为HP-DES用量。

图2 萃取剂用量对萃取效果的影响Fig.2 Effects of extractant volume on extraction

2.2.3 乳化剂体积 由于使用的萃取剂DES 为亲水型，常态下无法主动实现相分离，所以需要使用特定的乳化剂分离HP-DES 相和水相，达到萃取效果。本研究选择乙腈作为乳化剂，考查其用量对茶叶中各类农药平均回收率的影响。结果显示（图3），乙腈用量低于1.5 mL 时，在溶液顶部并未形成HP-DES 相；持续增加乙腈用量，在1.5～2.0 mL 内，各类农药平均回收率逐渐提高，继续提高乙腈用量，回收率则出现下降趋势，这是因为适量的乙腈能够使HP-DES 更加快速均匀地分布在样品溶液中，达到相平衡，提高萃取效果；乙腈用量过少时，乳化程度低，导致HP-DES 无法与水相分离形成相界面；当乙腈用量过大时，则会改变目标物在水相中的溶解度，导致萃取效率降低［33-34］。因而选择乳化剂乙腈用量为2 mL。

图3 乳化剂用量对萃取效果的影响Fig.3 Effects of emulsifier volume on extraction

2.2.4 离子强度 NaCl 等无机盐能够调节溶液体系中的离子强度，其原理是通过盐析作用使得目标物在待测液中的溶解度增大，加快HP-DES 在待测溶液中分布平衡的速度，从而达到减少HP-DES 和乳化剂乙腈的使用量，提高目标物萃取率的目的［35］，但由于NaCl是一种不易挥发的盐类，进入质谱时会产生较强的离子抑制效应，影响目标峰的响应，因此需要适量添加NaCl。选择0、0.02、0.05、0.07、0.1 g·mL-1的NaCl添加含量考察离子强度对农药萃取效果的影响，结果显示（图4），在0～0.05 g·mL-1的添加范围内，各类农药萃取回收率变化不明显，继续增加NaCl 含量至0.1 g·mL-1时，萃取回收率下降33.24～52.16 个百分点。同时，在样品溶液中添加0.05 g·mL-1NaCl 时能够降低HPDES 和乳化剂乙腈的使用量，因此最终选择NaCl 含量为0.05 g·mL-1。

图4 NaCl含量对萃取效果的影响Fig.4 Effect of NaCl concentration on extraction

2.2.5 涡旋时间 涡旋时间对萃取效果有较大影响，充分涡旋会提高目标物向HP-DES 相的转移速度，从而提高萃取效率［36-37］。由于本研究采用基质为茶叶样品，需要足够的涡旋时间保证萃取效果，因此选择1、3、5、10、13、15 min 6 个梯度探究涡旋时间对农药萃取效果的影响。结果表明（图5），涡旋时间在1～10 min范围内时，随涡旋时间增加，各类农药的萃取效果逐渐提高；当涡旋时间超过10 min时，农药的萃取效果无明显变化，因此选择涡旋时间为10 min。

图5 涡旋时间对萃取效果的影响Fig.5 Effect of vortex time on extraction

2.2.6 超声时间 超声能够加快HP-DES 在样品溶液中的扩散程度，使得萃取剂在待测液中分布均匀，起到很好的萃取效果［38］。本研究选择0、3、5、10、15 min 5 个时间水平考察超声时间对萃取效果的影响。结果显示（图6），超声时间对各类农药萃取效果的影响不明显，且超声时间过长，样品溶液温度会逐渐升高，可能会导致部分农药发生降解等变化，反而影响萃取效果，因此，本研究前处理中不采用超声操作。

图6 超声时间对萃取效果的影响Fig.6 Effect of ultrasonic time on extraction

2.3 基质效应评价结果

基质效应在茶叶农残检测中普遍存在，是影响检测结果的重要因素，通常以配置基质匹配标准曲线来校正农药残留检测受到的基质干扰［39］。由表3 可知，65 种农药在茶叶基质中的ME 值范围为-67.76%～64.37%，其基质抑制效应较为突出。因此采用茶叶基质配制相应基质匹配标准曲线，减少茶叶基质对农药残留定量结果的影响。

表3 65种农药线性、相关系数（r2）、LOQ、基质效应及回收率和重复性Table 3 The linearity， correlation coefficients （r2）， LOQ， matrix effect， the recovery and repeatability of 65 pesticides

表3（续）

表3（续）

表3（续）

2.4 方法学考察结果

2.4.1 线性范围和定量限 由表3 可知，茶叶中农药目标物在1～500 ng·mL-1浓度范围内线性关系良好，其线性相关系数（r2）均大于0.996，方法的定量限（LOQ）为0.12～9.76 μg·kg-1，证实该方法灵敏度较高。

2.4.2 方法的准确度与精密度 通过1.3.7 的添加回收试验计算相应的添加回收率和相对标准偏差（relative standard deviation， RSD），结果如表3 所示。在3 个加标水平下10 种农药的平均回收率分别为65.60%～109.55%（10 μg·kg-1）、67.31%～107.43%（50 μg·kg-1）和64.44%～110.15%（100 μg·kg-1），RSD均小于11.00%，所得结果均在可接受的范围内，符合多农药残留检测要求。

3 讨论

本研究基于HP-DES 结合HPLC-MS/MS 测定了茶叶中的65 种农药残留。《GB 23200.13-2016 茶叶中448 种农药及相关化学品残留量的测定 液相色谱-质谱法》［26］的前处理主要是利用乙腈高速离心提取并经固相萃取柱净化，对比预处理时间，国标中处理时间长达2～3 h，而本研究将预处理时间缩短到0.5 h 内。胡林林等［27］采用传统的QuEChERS 方法对茶叶中的47 种农药残留进行提取、净化，其药物的回收率为60%～120%；马佳丽等［28］采用分散固相萃取对茶叶基质进行处理，其24 种农药回收率为61.7%～98.8%；本研究采用HP-DES 进行处理，结合HPLC-MS/MS 对茶叶基质中的农药残留含量进行检测，其平均回收率为64.44%～110.15%，符合农药残留的检测要求，且在预处理时间和有机试剂的使用量上较前两者有优势；但相较贾玮等［29］的研究，本研究中的基质效应问题较为突出，后续研究需重点考虑如何降低基质效应，进一步降低农药残留的检出限，为茶叶的相关检测技术提供新的预处理方法。

4 结论

本研究以氯化胆碱（ChCl）和六氟异丙醇（HFIP）合成的HP-DES 为萃取剂，以乙腈为乳化剂，通过分散液液微萃取结合HPLC-MS/MS对茶叶基质中的农药多残留进行检测分析。单因素优化试验得出最佳的提取条件为：合成HP-DES的物质的量配比ChCl∶HFIP为1∶2，HP-DES用量为200 μL，乳化剂乙腈用量为2 mL，涡旋震荡时间10 min。该方法定量限为0.12～9.76 μg·kg-1，平均回收率在64.44%～110.15%之间，其RSD 均小于15%，基质效应为-67.76%～64.37%。表明该方法简便快捷、有机试剂用量少且试验成本低，具有良好的萃取效果，为茶叶中农药多残留检测提供了一种高效、可靠的技术手段。