60Co-γ辐照对饵料微藻粉的灭菌效果及其营养价值的影响

聂 凡 杨伊默 戴 颖 周广航 迟庆雷 加 晶，*

（1微藻生物能源与资源北京市重点实验室，北京 100142；2国家开发投资集团有限公司，国投生物科技投资有限公司，国投微藻生物科技中心，北京 100034）

微藻富含蛋白质、脂类、多糖、维生素、类胡萝卜素、微量元素等，具有丰富且全面的营养，在水产动物（鱼、虾、蟹、贝等）的养殖过程中发挥着不可替代的作用［1-2］。随着水产养殖业的不断发展，水产品对保障21 世纪的粮食安全和营养做出了日益重要的贡献［3］。2021 年我国海水养殖贝类、甲壳类和鱼类产量分别达到1 526.07、185.49 和184.38 万吨［4］。我国水产养殖业对微藻的需求量巨大，仅鱼、虾、贝苗对微藻的需求量就达到近3 万吨，每百万只鱼苗、虾苗和贝苗养殖到市售规格，分别需要食用60、1 和7 kg（干物质）的微藻［5］。微藻在水产养殖中不可或缺，是海洋和淡水水生食物链中的主要食物来源，充足且优质的微藻是保证水产养殖成功的前提。

目前水产养殖场常用的饵料微藻主要有等鞭金藻（Isochrysisspp.）、褐指藻（Phaeodactylumspp.）、角毛藻（Chaetocerosspp.）、海链藻（Thalassiosiraspp.）、四爿藻（Tetraselmisspp.）等。球等鞭金藻（Isochrysisgalbana）和三角褐指藻（Phaodactylumtricornutum）由于体积小、易消化、营养价值高，可满足水产动物在幼苗期正常生长发育的营养需求，具有提高育苗存活率、保证幼苗正常变态和发育、提高生长速度及体长和体重等各项性状指标、提高免疫力等综合作用［6-8］，并且能够明显强化轮虫、卤虫、桡足类、枝角类等次级饵料中多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid，PUFA）和各种维生素的含量，进而满足水产动物幼体对优质次级饵料的需求［9-10］，在水产经济动物的人工养殖中起着重要作用。微藻培养需要合适的温度、光照、水体营养等条件，气候、水质、地域等差异经常导致水产育苗场和养殖场的饵料微藻培养失败，进而导致水产动物因缺少饵料而养殖失败。集约化工厂化生产微藻藻粉储存使用可以有效解决水产养殖业面临的饵料微藻供应不稳定问题。

微生物的数量和营养成分含量是衡量饵料微藻藻粉质量的重要指标。目前饵料微藻粉在工厂化生产的过程中，一般采用冷冻干燥或喷雾干燥进行微藻生物质的干燥，微生物含量不能达到饲料卫生标准要求（现行饲料卫生标准［11］中没有藻粉类产品微生物具体限量要求，参考饲料用螺旋藻粉［12］和藻类及其制品［13］微生物限量标准），因此需要做灭菌处理。辐照灭菌技术在食品加工［14-15］和饲料加工［16］中被广泛使用，其原理是利用原子能照射微生物细胞，使微生物内部的DNA、RNA 或蛋白质等有机分子的化学键断裂、分子交联或碱基序列改变，导致细菌、病毒、微生物死亡，从而达到杀菌、减少损失、延长食品或饲料贮存时间的效果［17］。辐照灭菌技术具有非常高的安全性，是一种无污染、无残留、能耗低、成本低、杀菌完全，并能充分保留产品风味和营养成分的灭菌方法，而且辐照射线穿透能力强，无需开启包装便可直接灭菌，自动化水平高，操作简便快捷［18-19］。目前虽然有一些关于辐照技术处理螺旋藻粉的研究报道［20-23］，但不同饵料微藻间的营养成分存在较大差别，截至目前还没有辐照对球等鞭金藻粉和三角褐指藻粉灭菌效果和营养价值影响的报道。鉴于此，本研究采用不同辐照剂量对这两种藻的灭菌效果和营养成分的影响进行探索，以期为微藻水产饲料产品开发提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 藻种及其培养收获

球等鞭金藻和三角褐指藻藻种由国投生物科技投资有限公司和中国科学院水生生物研究所项目合作筛选获得，原初藻株从自然海域中分离获得，藻种由国投生物科技投资有限公司藻种库保存，藻种编号分别为GT7和GT6。

球等鞭金藻藻粉和三角褐指藻藻粉由国投生物科技投资有限公司国投微藻生物科技中心生产，藻种通过室外玻璃管道式光生物反应器培养，再经过离心收获、冷冻干燥、粉碎等一系列工艺流程制成藻粉，球等鞭金藻藻粉采用锡纸袋（200 g/袋）包装，三角褐指藻藻粉采用铁罐（200 g/罐）包装。

1.2 主要仪器设备与试剂

Agilent 7890B-5977A 气相色谱-质谱联用仪（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）、Agilent 7890B气相色谱-氢火焰离子化检测器（gas chromatographyflame ionization detector，GC-FID），美国安捷伦科技公司；Waters Alliance 高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）系统，包括e2695 高效液相色谱仪及2489紫外可见光检测器，美国沃特世公司。

脂肪酸标品及色素标品，美国Sigma-Aldrich 公司；改良型Bradford 蛋白分析试剂盒，生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.3 辐照灭菌处理

辐照装置为北京鸿仪四方辐射技术股份有限公司的60Co-γ 辐射源，剂量设4 和7 kGy 两个梯度，对装箱后的袋装球等鞭金藻藻粉（80 袋/箱）和罐装三角褐指藻藻粉（20 罐/箱）进行辐照灭菌。每个处理2 个重复。辐照前和辐照后的样品分别取样，检测样品的脂肪酸、色素、粗蛋白含量以及菌落总数、霉菌总数、大肠菌群和沙门氏菌。

对于球等鞭金藻藻粉，取若干袋7 kGy 剂量辐照灭菌后的球等鞭金藻藻粉样品，置于4 ℃冰箱中，于储存0、3、6、9、12、18 月取样，检测样品的菌落总数、霉菌总数、大肠菌群和沙门氏菌。

1.4 藻粉脂肪酸定性及定量分析方法

藻粉脂肪酸提取参考Jia 等［24］的方法。利用GCMS 进行脂肪酸的定性分析，利用GC-FID 进行定量分析。

1.5 藻粉色素定性及定量分析方法

藻粉色素提取参考Wang 等［25］的方法。利用Alliance HPLC定性定量分析藻粉中所含色素。

1.6 藻粉粗蛋白测定方法

藻粉粗蛋白提取参考Jia 等［24］的方法。粗蛋白含量使用改良型Bradford蛋白分析试剂盒测定。

1.7 藻粉微生物测定方法

样品微生物指标按照相应的国家标准进行检测，检测指标包括细菌总数［26］、霉菌总数［27］、大肠菌群［28］和沙门氏菌［29］。

1.8 数据分析

试验结果以平均值±标准差表示，均值的比较采用Duncan 多重比较进行单因素方差分析，数据分析采用SPSS 26.0完成。

2 结果与分析

2.1 辐照剂量对两种饵料微藻的灭菌效果

由表1可知，球等鞭金藻藻粉经过4和7 kGy两种不同剂量辐照后，细菌总数从初始值105CFU·g-1数量级水平降至102CFU·g-1，霉菌总数从初始值450 CFU·g-1降至102CFU·g-1以下，大肠菌群从初始值2 400 MPN·100 g-1降至30 MPN·100 g-1以下，沙门氏菌均未检出，微生物含量达到饲料卫生标准要求，说明4～7 kGy 剂量辐照可有效杀灭球等鞭金藻藻粉微生物。

表1 不同辐照剂量对两种饵料微藻藻粉微生物数量的影响Table 1 Effects of irradiation doses on microbial number of two kinds of microalgae powder

三角褐指藻藻粉在经过4 和7 kGy 两种不同剂量辐照后，细菌总数从初始值106CFU·g-1数量级水平降至102CFU·g-1，霉菌总数从初始值104CFU·g-1数量级水平降至101CFU·g-1，大肠菌群从初始值2 400 MPN·100 g-1降至30 MPN·100 g-1以下，沙门氏菌均未检出，微生物含量也达到饲料卫生标准要求（表1）。说明4～7 kGy 辐照剂量可有效杀灭三角褐指藻藻粉的微生物。

2.2 辐照剂量对两种饵料微藻藻粉营养成分的影响

2.2.1 辐照剂量对两种饵料微藻藻粉脂肪酸的影响球等鞭金藻藻粉的主要脂肪酸组分为C14∶0、C16∶0、C18∶1cis（Δ9）、C18∶3（Δ9，12，15）、C18∶4（Δ6，9，12，15）、C22∶6（Δ4，7，10，13，16，19）（DHA）。球等鞭金藻藻粉在经过4 kGy 剂量辐照处理后，DHA、PUFA 及总脂肪酸含量显著升高（P<0.05）；经过7 kGy 剂量辐照处理后，DHA、PUFA 及总脂肪酸含量均未发生显著变化（P>0.05）（表2）。

表2 球等鞭金藻藻粉脂肪酸组分含量随辐照剂量的变化Table 2 Variation of fatty acid content of I. galbana powder with different irradiation dose/（mg·g-1）

三角褐指藻藻粉的主要脂肪酸组分为C14∶0、C16∶0、C16∶1cis（Δ9）、C20∶5（Δ5，8，11，14，17）（EPA）。三角褐指藻藻粉经过4 和7 kGy 两种不同剂量辐照处理后，EPA、PUFA 及总脂肪酸含量均未发生显著变化（P>0.05）（表3）。

表3 三角褐指藻藻粉脂肪酸组分含量随辐照剂量的变化Table 3 Variation of fatty acid content of P. tricornutum powder with different irradiation dose /（mg·g-1）

2.2.2 辐照剂量对两种饵料微藻藻粉色素的影响球等鞭金藻藻粉经过4 kGy 剂量辐照处理后，岩藻黄素和叶绿素含量显著降低，降幅为10%～15%，总类胡萝卜素含量未发生显著变化；经过7 kGy剂量辐照处理后，色素各组分含量整体未发生显著变化。三角褐指藻藻粉经过4和7 kGy两种不同剂量辐照处理后，叶黄素、β-胡萝卜素和叶绿素含量较辐照前显著降低，降幅为10%～20%，总类胡萝卜素含量未发生显著变化，两种辐照剂量之间结果无显著差异（图1）。

图1 辐照剂量对两种藻粉色素含量的影响Fig.1 Effect of irradiation dose on pigment content of two kinds of microalgae powder

2.2.3 辐照剂量对两种饵料微藻藻粉粗蛋白的影响 球等鞭金藻藻粉在经过4 和7 kGy 两种不同剂量辐照处理后，粗蛋白含量与辐照前相比均未发生显著变化（P>0.05）。三角褐指藻藻粉样品在经过4 kGy辐照处理后，粗蛋白含量与辐照前相比未发生显著变化（P>0.05），在经过7 kGy 剂量辐照后，粗蛋白含量显著升高（P<0.05）（图2）。

图2 球等鞭金藻和三角褐指藻藻粉藻粉粗蛋白含量随不同辐照剂量的变化Fig.2 Variation of crude protein content of I. galbana and P. tricornutum powder with different irradiation dose

上述结果表明，4 和7 kGy 剂量的辐照处理未显著降低球等鞭金藻藻粉和三角褐指藻藻粉总脂肪酸、总类胡萝卜素以及粗蛋白的含量，说明4 ～7 kGy 辐照剂量未破坏球等鞭金藻藻粉和三角褐指藻粉的主要营养成分。

2.3 辐照灭菌藻粉中微生物在保存期内的变化

经7 kGy辐照处理的球等鞭金藻藻粉，在4 ℃避光条件下储存18个月内，细菌总数、霉菌总数、大肠菌群及沙门氏菌与起始时均无显著差异（P>0.05），数量均符合饲料卫生标准要求（表4）。说明7 kGy 剂量的辐照处理能对球等鞭金藻藻粉进行有效灭菌，且灭菌后藻粉的微生物指标在适当储存条件下18 个月内满足饲料卫生标准要求。

表4 经7 kGy剂量辐照处理的球等鞭金藻藻粉微生物含量18个月内的变化Table 4 Variation of microbial number of I. galbana powder irradiated by 7 kGy within 18 months

3 讨论

3.1 两种饵料微藻藻粉辐照灭菌的有效剂量

辐照灭菌技术已应用于食用螺旋藻粉的杀菌处理。现行《NY/T 2318-2013 食用藻类辐照杀菌技术规范》［30］（适用于螺旋藻）规定食用藻类辐照杀菌的最低有效剂量为4.0 kGy，最高耐受剂量为8.0 kGy。在螺旋藻粉中，4.0～6.0 kGy剂量辐照处理可以使其微生物指标均达到国家卫生标准［22］，杀菌的最低有效剂量为4.0 kGy，最高耐受剂量为8.0 kGy［20］，7 kGy 剂量辐照处理可以使总带菌量迅速降低［21］。本研究中，球等鞭金藻藻粉和三角褐指藻藻粉两种饵料微藻在经过4和7 kGy两种不同剂量辐照处理后，细菌总数和霉菌总数均显著降低（P<0.05），大肠菌群均降低至检测限以下，沙门氏菌未检出，微生物指标均达到饲料卫生标准要求。本试验结果还表明，4～7 kGy 辐照剂量可对球等鞭金藻藻粉和三角褐指藻藻粉进行有效灭菌，与已报道的螺旋藻粉的灭菌剂量基本一致［20-22］。

3.2 辐照灭菌对藻粉产品储存的影响

微生物是导致产品变质的重要因素，辐照处理可以有效杀灭产品中的微生物，从而延长产品保质期［19］。经7 kGy 剂量辐照后的螺旋藻干粉在储存温度为9.5～21.3 ℃的条件下，微生物指标4个月内无显著变化［21］。辐照后包装完好的食用螺旋藻粉在常温条件下的保质期甚至可达2 年［20］。本研究中，球等鞭金藻藻粉经7 kGy剂量辐照处理后，细菌总数、霉菌总数、大肠菌群及沙门氏菌均达到国家卫生标准，其在4 ℃避光条件下储存18个月后，微生物指标无显著变化（P>0.05），说明辐照处理后藻粉可在较长时间内保持卫生质量。

3.3 辐照灭菌对两种饵料微藻藻粉营养价值的影响

PUFA、类胡萝卜素和蛋白质等赋予微藻丰富的营养功能和应用价值。PUFA 能够提高水产动物的存活率、抗氧化能力、抗应激和抵御疾病的能力［31］。微藻富含PUFA，是DHA及EPA的重要来源，可作为鱼粉和鱼油的良好替代源，确保水产养殖的可持续性发展。球等鞭金藻富含DHA，占其总脂肪酸含量的9.68%～12.32%［32］，本研究发现，球等鞭金藻藻粉经4和7 kGy辐照处理后，DHA、PUFA和总脂肪酸含量未显著降低（P>0.05）。三角褐指藻富含EPA，含量可达到总脂肪酸的30%［33-34］，三角褐指藻藻粉经4 和7 kGy 辐照处理后，EPA、PUFA和总脂肪酸含量未发生显著降低（P>0.05）。螺旋藻干粉经6 kGy 辐照处理后，亚油酸、γ-亚麻酸、α-亚麻酸等PUFA 的相对含量未发生显著变化［35］。以上结果均表明，4～7 kGy 剂量辐照处理不会降低藻粉的PUFA含量，不影响藻粉脂肪酸的营养价值。

类胡萝卜素是微藻重要的营养物质，具有提高免疫力、抗氧化及清除自由基等功能［36］。对于螺旋藻粉，其胡萝卜素含量随辐照剂量加大而明显降低［23，35］。本研究中，球等鞭金藻藻粉和三角褐指藻藻粉在经过4 和7 kGy 两种不同剂量辐照处理后，总类胡萝卜素含量均未发生显著降低（P>0.05）。出现差异的原因可能是球等鞭金藻和三角褐指藻与螺旋藻的色素成分及含量差异较大，且本研究中辐照剂量也较低，因此类胡萝卜素相对稳定。

微藻的蛋白质含量一般在40%以上，在微藻干基物质中占比最高［37］。在0～13.5 kGy辐照剂量范围内，螺旋藻粉粗蛋白含量未受到显著影响［22-23］。在0～20 kGy辐照剂量范围内，南美白对虾配合饲料蛋白质含量也未受到显著影响［38］。本研究中，球等鞭金藻藻粉和三角褐指藻藻粉在经过4 和7 kGy 两种不同剂量辐照处理后，粗蛋白含量均未显著降低（P>0.05）。以上结果均表明，在辐照处理过程中，粗蛋白较为稳定，可以耐受较高的辐照剂量。

本试验结果表明，在4～7 kGy 辐照范围内，球等鞭金藻藻粉和三角褐指藻藻粉两种饵料微藻主要营养成分均未被破坏，营养价值不受辐照灭菌影响，辐照灭菌工艺对于这两种饵料微藻是可行的。水产养殖中常用饵料微藻种类多样，不同水产动物及不同育苗时期适用的饵料微藻不同，辐照处理对其他饵料微藻营养价值的影响仍有待进一步研究。

4 结论

本试验探究了60Co-γ辐照灭菌对饵料微藻球等鞭金藻藻粉和三角褐指藻藻粉微生物和营养成分的影响，结果表明，辐照剂量为4～7 kGy 的60Co-γ 辐照能对两种饵料微藻藻粉进行有效灭菌，且不影响两种饵料藻粉的营养价值。本研究为球等鞭金藻藻粉和三角褐指藻藻粉两种水产饵料微藻在辐照灭菌工艺参数的选择上提供了参考，为这两种藻粉开发为水产饲料的加工工艺提供了依据。