美乐葡萄在乳山和德州地区品质特征比较分析

于 雪 王超萍 任艳华 王 博 付广青 房经贵，*

（1南京农业大学园艺学院，江苏 南京 210095； 2山东省葡萄研究院，山东 济南 250199；3江苏省农业科学院，江苏 南京 210014）

葡萄是产业链最长、全球最重要的果树之一。由于葡萄果实品质是葡萄酒的主要影响因素，葡萄酒的感官属性与其地理来源相关。虽然葡萄的环境适应性较强，但生长条件的差异会对酿酒葡萄的果实性状产生重大影响［1］。

红葡萄酒葡萄（Vitis viniferaL.）品种美乐是早熟品种，能够适应不同的气候条件［2］，是世界上栽培最多的葡萄品种之一。全球美乐葡萄园面积约为260 000 hm2，在意大利，约有25 000 hm2土地专门用于种植美乐［3］。在我国，山东省是美乐葡萄主栽地区，集中分布于胶东半岛，在鲁中、鲁北等地区有零星分布［4］。美乐葡萄酒作为市场上最受欢迎的红酒品种之一，既可用于制作单一品种葡萄酒，也可用于制作混合葡萄酒。

前人研究发现，转色期到成熟期是葡萄浆果变化最大以及内在品质形成的关键时期［5］。此阶段与果实成熟过程有关，包括颜色、风味和香气的变化等［6-9］。进入转色期之后葡萄树体的生理代谢增强，其中与品质形成相关的K+的日积累速率增加2～4 倍，韧皮部流动水分的速度增加了10倍［5］。

为了探究美乐葡萄在山东的品质表现，本研究对胶东半岛乳山种植的美乐的糖、酸、花青素和酚类等品质性状及其在果实转色期的变化特点进行分析，并与德州地区种植的美乐品质性状等进行比较分析。进一步利用RNA-seq 分析从分子水平上解析两地美乐葡萄果实品质异同的机理，旨在对胶东半岛美乐葡萄的品质特征及其与德州美乐葡萄的品质差异进行分析，为在胶东半岛进一步发展美乐葡萄以及美乐葡萄的引种推广提供一定的理论指导。

1 材料与方法

1.1 植物材料

以山东德州奥德曼酒庄（DZ）与乳山台依湖酒庄（RS）的美乐葡萄果实为试验材料。葡萄采用篱架树形，树龄为5～10年。德州酒庄美乐产量为9 t·hm-2，乳山产量为3.6 t·hm-2。葡萄园均采用常规管理措施。乳山台依湖酒庄（36.89°N，121.52°E），地处山东半岛东南端、胶东低山丘陵区，暖温带东亚季风型大陆性气候，年平均日照时数2 095.5 h，年平均气温12.4 ℃，年降水量428.3～458.8 mm；德州奥德曼酒庄（37.45°N，116.29°E），地处山东西北部、黄河下游冲积平原，温带季风气候，年平均日照时数2 592 h，年平均气温12.9 ℃，平均无霜期长达208 d，年平均降水量为547.5 mm。

样品分别在转色阶段（50%的浆果开始变色，M）和成熟期（T）收集。样品收集后立即在液氮中单独冷冻。将所有样品储存在-80 °C条件下，以备后续分析。

1.2 生理生化指标测定

采用游标卡尺测定果实纵向直径和横向直径，采用电子天平测定粒重；总可溶性固形物（total soluble solid）由PAL-1 手持测糖仪（Atago，日本）测定；总花色苷的测定参照纠松涛［10］的方法，采用pH 值示差法；参照Guan 等［11］的方法，使用液相色谱-质谱联用（liquid chromatograph mass spectrometer，LC-MS）测定花色苷成分。总酚的测定采用高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法［12］；使用氢氧化钠溶液滴定法测定可滴定酸含量［13］；可溶性糖含量的测定参考文献［14］。

1.2.1 果实糖组分和有机酸组分的提取与测定 糖酸的测定采用高效液相色谱法，参照先前报道的方法并加以改良［15-16］。取0.2 g 果肉粉末于2 mL 离心管中，加入1.5 mL 超纯水；80 ℃加热30 min；加热后12 000 r·min-1条件下离心10 min，吸取上清液到干燥的容器中（10 mL 管）；重复上述步骤2 次。合并2 次的上清液，吸取上清液过滤到进样瓶，待测。

糖组分的测定色谱条件：采用HPLC-MLSD 色谱仪（安捷伦，上海），Prevail Carbohydrate ES 5µ柱（100 mm×4.6 mm，5 µm）；流动相：V（乙腈）∶V（水）=80∶20；柱温：50 ℃；流速：1.0 mL·min-1；进样量：20 µL。有机酸组分的测定色谱条件：色谱柱为Discovery C18 柱（25 cm×4.6 mm，5 m）；流动相为50 mmol·L-1的K2HPO4溶液，用磷酸调节pH 值至2.4；柱温30 ℃；流速0.5 mL·min-1；进样量2 µL；检测波长为210 nm。

1.2.2 果实香气含量的分析 葡萄果实香气的提取采用顶空固相微萃取（headspace solid phase microextraction，HS-SPME）技术。提取方法参照文献［17］并进行了改良：称取3 g 研碎的葡萄果实装到20 mL 的顶空瓶中，向其中加入3 mL 饱和NaCl 溶液，再加入2 µL 色谱级3-辛醇（使用乙醇梯度稀释至万分之一浓度）作为内标，加盖并与柱面混合器混合10 min，插入50/30 µm PDMS/DVB/CAR SPME 萃取头（Supelco，美国）。

气相色谱-质谱联用（gas chromatograohy-mass spectrometry，GC-MS）测定：使用J＆W 122-4732 DB-17ms（30 m×0.25 mm×0.25 µm）色谱柱在GC-MS/MS Quantum TSQ 9000/TRACE 1310（Thermo Fisher Scientific，美国）上进行分析。MS条件：质谱仪采用EI模式，电压为70 eV；离子源温度为230 ℃；扫描速率为2.88 scan·s-1；质谱检测范围为29～540 m/z，载气为氦气，流速为1.0 mL·min-1。

1.3 转录组学分析

使用十六烷基三甲基溴化铵（hexadecyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）方法提取总RNA。文库制备和转录组测序由北京新近纪科技股份有限公司完成。使用DESeq2 进行差异表达基因（differential gene expression）分析。采用clusterProfile（4.2.1）软件对GO富集和KEGG通路进行分析。

1.4 数据处理

采用Microsoft Excel 2019 软件处理数据，使用TBtools v1、Prism 8.0.2 制图，并使用SPSS 17.0 和Blast2GO分析软件进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 美乐葡萄在两地成熟期的品质特征

分析表明，两个地区美乐葡萄成熟期果实特征相似（图1）。乳山台依湖酒庄（以下称乳山）与德州奥德曼酒庄（以下称德州）收集的葡萄果实的粒重、横径、纵径、TSS、可溶性糖以及总有机酸分别相差0.41 g、0.247 mm、0.98 mm、2.1 个百分点、0.505 个百分点、0.188 个百分点。花色苷、酚含量差异较大，乳山葡萄含量分别为0.385、8.553 mg·g-1，德州为3.576、12.278 mg·g-1，相差3.196、3.735 mg·g-1。乳山葡萄果实中可溶性糖和总有机酸含量高于德州，总花色苷、总酚、粒重、横径、纵径以及TSS含量低于德州。

图1 美乐葡萄在乳山和德州的转色期和成熟期生理指标的测定Fig.1 Determination of physiological indicators of Véraison stage and maturity stage of Merlot berries in Rushan and Dezhou

葡萄果实中酸成分主要包括柠檬酸、苹果酸、酒石酸，糖成分主要包括葡萄糖和果糖。本研究结果如图1 所示，乳山和德州葡萄果实主要酸成分都为酒石酸且差异极显著，分别为3.271、2.666 mg·g-1。乳山果实中苹果酸和柠檬酸含量与酒石酸分别相差1.925、3.15 mg·g-1，德州分别相差0.883、2.34 mg·g-1。乳山葡萄果实中的葡萄糖和果糖含量都高于德州，分别相差5.288、1.111 mg·g-1。

进一步分析两地差异较大的花色苷、酚的种类及主要成分含量发现（图2），虽然乳山葡萄果实花色苷种类为25 种，德州为14 种，但德州花色苷主要成分含量高于乳山。德州葡萄果实中总酚含量是乳山的1.4倍。两种果实的主要多酚成分含量差异显著或极显著。表没食子儿茶素为乳山浆果中检测到的主要多酚成分，是表儿茶素没食子酸酯含量的60 倍。表儿茶素没食子酸酯为德州浆果中检测到的主要多酚成分，是原花青素B1含量的76倍。

图2 美乐葡萄在乳山和德州成熟期花色苷及多酚分析Fig.2 Analysis of anthocyanins and polyphenols in the ripening stages of Merlot grapes in Rushan and Dezhou

2.2 两地果实从转色期到成熟期品质特征的变化

在转色时期，美乐葡萄在两个酒庄的品质性状存在一定差异（图1）。乳山葡萄果实中总有机酸含量、横径、纵径、粒重高于德州，可溶性糖、TSS、总花色苷、总酚含量低于德州。可溶性糖、总酚、花色苷、TSS 含量在不同的环境条件下差异极显著。可溶性糖、总酚以及TSS相差3.797个百分点、3.133 mg·g-1、2.133个百分点。德州葡萄果实中总花色苷含量是乳山的9倍。

从转色期到成熟阶段，美乐的品质在各方面均发生变化（图1）。葡萄果实有机酸含量降低，可溶性糖、TSS、总花色苷、总酚、横径、纵径、粒重均升高。其中，两个地区总有机酸、TSS、总酚、粒重变化量相近，乳山果实变化量分别为0.579个百分点、2.033个百分点、4.17 mg·g-1、0.367 g，德州分别为0.562 个百分点、2.133 个百分点、4.776 mg·g-1、0.82 g。乳山果实中可溶性糖含量在转色到成熟阶段变化较大，为6.709 个百分点，德州为2.41 个百分点。德州葡萄果实中总花色苷含量变化较大，为3 mg·g-1，乳山变化量为0.321 mg·g-1。

2.3 两个地区收集的成熟阶段美乐葡萄的转录组分析

为了了解美乐葡萄在不同产区基因的表达情况，对德州奥德曼和乳山台依湖酒庄的美乐葡萄的转色和成熟阶段进行转录组分析，并将获得原始数据进行整理。测序质量良好，测序数据可用于进一步分析。

分析结果表明，两地均是转色期的基因数量多于成熟期（表1）。转色期到成熟期，乳山和德州基因数量分别减少295、37 个。两个时期数量相近，乳山的基因数量较多，分别为22 157、21 862 个。进一步以Padj≤0.05 和|log2FoldChange|≥1 作为筛选差异表达基因（DEGs）的阈值，发现乳山的DEGs 表达数量较多，为5 695，约占所有表达基因的26%；德州的表达基因数量为4 488个，占所有表达基因的22%。

表1 不同地区不同时期表达基因数和DEG数Table 1 The number of expressed genes and the number of DEGs in each winery in different periods

进一步总结分析DEGs的上调和下调基因，发现两个地区的上调基因数量均少于下调基因数量。乳山的上下调基因数量分别为2 340、3 355 个，德州的分别为2 092个、2 396个（图3-B）。比较两个酒庄美乐葡萄的DEGs，发现有1 610个相同的基因（图3-A）。根据Padj≤0.05 和|log 2(FoldChange) |≥1 的阈值筛选出DEGs（图3-C），分析转色时期与成熟时期两个地区不同染色体上的差异基因表达水平。结果表明，同一产区高表达基因在转色期和成熟期的变化趋势相似。

图3 两个地区美乐葡萄的 DEG 分析Fig.3 DEG analysis of Merlot grapes in two regions

2.4 差异表达基因GO 功能分析和KEGG 代谢通路分析

使用Blast2GO中的GOseq方法进行分析，认为Padj≤0.05的GO条目明显更丰富。富集到836组生物功能，包括生物过程431组、细胞组分113组和分子功能292组。其中，碳水化合物分解代谢过程、羧酸生物合成过程、丙酮酸代谢过程、糖酵解过程、有机酸代谢过程，磷酸核糖生物合成过程，谷氨酰胺家族氨基酸代谢过程显著富集，表明这些代谢途径的基因可能是导致果实品质形成差异的主要因素（表2）。

表2 两个地区的差异表达基因GO功能分析Table 2 Analysis of GO function of differentially expressed genes in two regions

将每个产区的DEG 映射到KEGG 数据库，乳山和德州均注释了114条KEGG途径。为了进一步总结与浆果品质形成相关的生物学途径，本研究选择了10 个重要途径进行分析（表3）。转录组结果发现，乳山在柠檬酸循环、乙醛酸和二羧酸代谢途径中富集的DEGs数量分别为32、36个，德州的数量分别为18、24个。两个地区主要酸成分都为酒石酸，其中乳山的酸成分含量高于德州。酒石酸的生物合成始于L-抗坏血酸。两个地区在抗坏血酸和醛糖代谢途径中富集的DEGs 数量均为22个，但德州的下调数量较多，为16个。对于糖成分含量，乳山在果糖和甘露糖代谢、淀粉和蔗糖代谢途径中富集的DEGs数量分别为34、60个，德州为22、44个。

表3 转录组数据中与性状相关的代谢途径及DEG 数Table 3 Trait-related metabolic pathways and number of DEGs in transcriptome data

3 讨论

葡萄是世界上种植较为广泛的多年生水果作物之一。葡萄在不同环境中生长的果实品质存在差异。同时这种变异性也使现有品种适应特定的种植区域，并产生不同风格的葡萄酒。

葡萄果实的花色苷含量和组成受温度、光照和湿度等环境因素的影响［18］。研究发现，在适度的光照条件下，大多数葡萄品种的花色苷含量会随着光照强度的增加而增加［19-20］，适宜的温度也可以促进花青素的合成［21-23］。本研究中，德州美乐葡萄的总花色苷含量高于乳山（图1），可能由于德州有更适宜美乐栽培的温度、光照和湿度。Qin 等［24］研究表明，乌鲁木齐的光照强度、温度和湿度较低，更有利于酚类物质的积累。本研究中，德州葡萄果实的多酚含量高于乳山，可能与德州较低的光照强度、温度和湿度相关。此外，在主要检测出的6 种多酚组分中，由于生态环境的差异，成分含量产生了较大差异。其中，乳山葡萄果实中检测到的主要多酚成分为表没食子儿茶素，德州的主要多酚成分为表儿茶素没食子酸酯。糖和酸的含量也受葡萄自身以及外界生长环境的影响。前人研究发现，对糖分积累影响较大的气象因子有日平均气温、日照时数、最高气温、降水量等，其中降水量的增加不但会降低葡萄园的光照，阻碍光合作用，影响果实成熟，而且葡萄成熟期过多的降水还会导致葡萄果实中风味物质浓度降低［25-27］。另外，毛如志等［28］研究发现，高海拔产区的美乐葡萄比低海拔产区果实积累更多的有机酸和糖类等物质。本试验中，乳山葡萄果实的可溶性糖、总有机酸含量均高于德州，推测与其低降水量和较高海拔有关。

葡萄中的主要花色苷包括矢车菊素-3-O-葡萄糖苷（cyanidin-3-O-glucoside）、牵牛花素-3-O-葡萄糖苷（petunidin-3-O-glucoside）、飞燕草素-3-O-葡萄糖苷（dephinidin-3-O-glucoside）、锦葵素-3-O-葡萄糖苷（peonidin-3-O-glucoside）和牡丹素-3-O-葡萄糖苷（malvidin-3-O-glucoside）［29］。这些单体花色苷进一步经历酰化或聚合，形成花色苷衍生物［30］。本研究中，山东两个地区美乐葡萄中花色苷的主要成分为锦葵素-3-O-葡萄糖苷及其酰化衍生物（图2），与前人研究结果一致［29，31］。德州美乐葡萄中花色苷含量高于乳山，与德州花色苷主要成分的含量较高相关。

为了进一步总结与葡萄果实品质形成相关的机制，对差异表达基因进行了GO功能分析和KEGG代谢通路分析。分析发现，上调或下调基因的数量可能与果实表现出的农艺性状有关。葡萄果实中的可滴定酸含量较低，但可滴定酸对果实品质有重要影响。两个地区葡萄果实的主要酸成分都为酒石酸。酒石酸由L-抗坏血酸合成。在坏血酸和醛糖代谢途径中，乳山上调基因较多，可能导致其较高的酸含量。另外，乳山在柠檬酸循环、乙醛酸和二羧酸代谢途径中富集的DEGs 数量以及上调基因数量均高于德州。葡萄属于己糖积累型果树，成熟果实中可溶性糖主要为葡萄糖和果糖［32-33］。糖分来源于光合产物的运输与积累，蔗糖是主要的光合产物，在果实中经转化酶分解为葡萄糖和果糖。本研究中乳山淀粉和蔗糖代谢途径差异基因以及上调基因均多于德州，可能导致乳山较高的糖含量［34］。另外，果实中糖含量取决于糖代谢关键酶的活性与含量［35］。乳山转录组中，与果糖-葡萄糖生物合成和代谢相关的α-淀粉酶、蔗糖合酶和己糖激酶的上调基因数量均多于德州。

4 结论

本研究通过比较分析乳山和德州两地美乐葡萄果实的生理指标粒重、横径、纵径和TSS、可溶性糖、总有机酸、酚、花色苷含量，发现两地区美乐葡萄品质各具区域特色，其中德州地区葡萄果实中花色苷、酚类含量较高，乳山地区的可溶性糖和总有机酸含量较高。此外，基于转录组数据构建的两地区美乐葡萄在转色期和成熟期的差异表达，进一步解释了两地葡萄果实中糖酸含量差异的原因。