凶险性前置胎盘组织中VEGF、sFlt-1表达及其与胎盘植入的关系

王珊珊,李 燕,尤志格

(洛阳安和医院妇科门诊手术室,河南 洛阳 471000)

凶险性胎盘前置是指上次为剖宫产,而此次妊娠为前置胎盘,且胎盘附着于子宫瘢痕处。而胎盘前置及剖宫产史是造成胎盘植入的高危因素,有临床数据表示[1,2],凶险性胎盘前置患者发生胎盘植入的风险高达50%。目前,胎盘植入被认为与蜕膜发育不良、滋养细胞过度侵袭相关。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)及其受体(soluble fms-like tyrosine kinase-1,sFlt-1)在血管形成过程中发挥重要作用,胎盘绒毛合体滋养细胞所产生的VEGF可促进胎盘绒毛血管生成,而VEGF及sFlt-1表达失常可能导致胎盘滋养细胞侵袭能力改变,引起胎盘植入或胎盘浅着床[3,4]。研究凶险性胎盘前置-胎盘植入患者胎盘组织内VEGF及sFlt-1表达情况,可能在探索胎盘植入机制中具有积极作用。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

将本院2019年1月至2020年6月收治的76例凶险性前置胎盘患者纳为观察组,根据是否伴有胎盘植入,分为观察组-1(胎盘植入,n=22)与观察组-2(非胎盘植入,n=54),同时将因其他因素行剖宫产的30例产妇纳为对照组。(1)凶险性前置胎盘诊断标准[5]:前次有剖宫产史,此次妊娠为前置胎盘。前置胎盘定义为妊娠28周以后,胎盘附着于子宫下段,覆盖宫颈管内口,位置较胎儿先露低。(2)胎盘植入诊断标准[5]:术前超声检查提示胎盘后间隙消失,胎盘血窦丰富,术中,胎儿娩出后,胎盘不能自行剥离,徒手剥离过程中可见胎盘与子宫壁部分或全部相连,术后病理检查证实为胎盘绒毛侵入子宫肌层。(3)纳入标准:凶险性前置胎盘患者及胎盘植入者分别满足以上诊断标准,因病情需要行剖宫产终止妊娠;对照组为因社会因素、胎位不正等其他原因行剖宫产者;所有被研究对象均为单胎妊娠;剖宫产前均未临产,无胎膜早破。(4)排除标准:排除合并妊娠期高血压者、妊娠期糖尿病等其他妊娠合并症者,合并凝血功能障碍、多器官衰竭、恶性肿瘤、急慢性感染性疾病、免疫系统疾病者。本研究经医院伦理委员会批准,参与者知情且签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 血清VEGF及sFlt-1水平检测

剖宫产手术前12h内,抽取被研究对象外周静脉血6mL置于促凝管内,待血液完全凝固后,4℃条件下,2000rpm/min离心10min,取上层血清,置于-80℃冰箱内保存。采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清VEGF及sFlt-1浓度。人血管内皮生长因子(VEGF)ELISA试剂盒及人可溶性Fms样络氨酸激酶受体1(sFlt-1)ELISA试剂盒均购自上海博谷生物技术公司,严格按照试剂盒相关步骤进行检验操作,最终得出检验样本中VEGF及sFlt-1浓度。

1.2.2 胎盘组织内VEGF及sFlt-1 mRNA表达

1.2.2.1取材

于胎盘娩出后,取胎盘全层。A.凶险性前置胎盘非胎盘植入组及对照组取材部位为:脐带根部附着处的对应区域。B.凶险性前置胎盘胎盘植入组取材部位为植入病灶中心。组织大小约为1.5cm×1.5cm×1.0cm。取材过程中注意避开出血及钙化区域,无菌0.9%NaCl反复冲洗,无菌纱布吸干水分,置于10%福尔马林中保存待用。

1.2.2.2 Real-time ROC检测

(1)提取总RNA:①取100g胎盘组织,置于1.5mLEP管内,加入Tanzol UP后不断研磨。②将匀浆液移至离心管内,室温下静置5min,12000rpm 离心5min,取其上清移至新的离心管内。③向上述离心液中加入氯仿,盖紧离心管盖,距离摇晃使其充分乳化,静置5min后,同样转速离心15min。④取匀浆无色上清液至新的离心管内。⑤加入与上清液同等体积的异丙醇,将其混匀,静置10min,同样转速离心10min。⑥去除上清,保留底部沉淀,加入75%乙醇1mL洗涤离心管管壁,同样转速离心5min,去除乙醇。⑦室温干燥沉淀2～5min,加入100μLRNase-free dH2O,反复吹打,充分溶解RNA。

(2)逆转录及荧光定量PCR:①RNA浓度测量:取提取好的RNA2μL于PE管,加入98μL RNaes-free dH2O,同样100μL RNaes-free dH2O作为空白对照,检测提取RNA浓度。②引物设计:引物设计采用Primer 3软件,引物序列,SFlt-1上游引物:GTCATCACTCCTAAGCTGCCTTACA,下游引物:TGTTGGAAATCCTGGAACAGAAATC。VEGF上游引物:5’-CAGACGGACAGAAAGACAGAT-3’下游引物:5’-CAGGTGAGAGTAAGCGAAGG-3’③准备PCR管,依次加入反应物,首先94℃预变性5min,72℃延伸7min,反应完成后取5μL PCR扩增产物0.9%琼脂糖凝胶电泳检测鉴定。④按下Real-time RCR,每个反应重复3次,设计实验组与阴性对照组,配置反应液时先配置总反应液再分装。⑤荧光定量PCR数据处理:待反应结束后,通过AB17500荧光定量PCR仪进行数据处理。

1.3 观察指标

(1)根据胎盘侵入子宫肌层深度,将凶险性前置胎盘胎盘植入组患者分为A、B、C 3组,其中A组为黏连性胎盘,B组为植入性胎盘,C组为穿透性胎盘。(2)比较观察组-1、观察组-2及对照组血清VEGF、sFlt-1水平及胎盘中VEGF、sFlt-1表达水平。(3)观察不同胎盘植入深度患者血清VEFG、sFlt-1水平及胎盘中VEGF、sFlt-1表达水平。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 一般资料比较

观察组-1及观察组-2妊娠次数、分娩次数、术中出血量均显著高于对照组(P<0.05),观察组-1术中出血量、手术时间及术后住院时间均显著高于观察组-2与对照组(P<0.05)。

表1 3组一般资料比较

2.2 血清VEGF及sFlt-1水平比较

3组血清VEGF水平无显著性差异(P>0.05),3组血清sFlt-1水平差异显著(P<0.05),其中观察组-1血清sFlt-1水平显著高于观察组-2与对照组(P<0.05),观察组-2血清sFlt-1水平显著高于对照组(P<0.05),见表2。

表2 3组血清VEGF及sFlt-1水平比较

2.3 不同植入深度患者血清VEGF及sFlt-1水平比较

胎盘植入不同深度患者血清VEGF无显著性差异(P>0.05),血清sFlt-1水平差异显著(P<0.05),C组患者血sFlt-1水平显著高于A、B两组(P<0.05),B组血清sFlt-1水平与A组无显著性差异(P>0.05),见表3。

表3 不同植入深度患者血清VEGF及sFlt-1水平比较

2.4 胎盘组织中VEGF及sFlt-1表达量比较

3组胎盘组织中VEGF mRNA表达无显著性差异(P>0.05),3组sFlt-1 mRNA表达量及VEGF/sFlt-1差异显著(P<0.05),其中观察组-1胎盘组织中sFlt-1 mRNA表达量显著高于观察组-2与对照组(P<0.05),VEGF/sFlt-1显著低于观察组-2与对照组(P<0.05),观察组-2胎盘组织中sFlt-1 mRNA表达量显著高于对照组(P<0.05),VEGF/sFlt-1显著低于对照组(P<0.05),见表4。

表4 3组胎盘组织中VEGF及sFlt-1 mRNA表达量比较

2.5 不同植入深度患者胎盘组织VEGF及sFlt-1表达量比较

不同植入深度患者胎盘组织VEGFmRNA表达量无显著性差异(P>0.05),但sFlt-1 mRNA表达量及VEGF/sFlt-1差异显著(P<0.05),其中C组sFlt-1 mRNA表达量显著高于A、B两组(P<0.05),VEGF/sFlt-1显著低于A、B两组(P<0.05),B组sFlt-1 mRNA表达量显著高于A组(P<0.05),VEGF/sFlt-1显著低于A组(P<0.05),见表5。

表5 不同植入深度患者胎盘组织VEGF及sFlt-1mRNA表达量比较

3 讨论

剖宫产手术、子宫手术史是引起胎盘植入的重要因素,剖宫产及其他子宫手术史将引起子宫内膜受损,进而增加胎盘植入的风险。胎盘植入的形成与子宫下段蜕膜发育不良、脱膜层缺失,导致胎盘绒毛穿透底蜕膜有关[6～8]。而前置胎盘的主要病因也是子宫下段蜕膜层缺失,胎盘植入与胎盘前置有着相似的病理原因[9～11]。本文将医院近年来收治的76例凶险性胎盘前置患者纳为研究对象,其中有22例患者合并胎盘植入,将同期因社会因素等其他原因行剖宫产的30例产妇纳为对照组。分析发现,与对照组产妇相比,凶险性前置胎盘患者妊娠次数、分娩次数更多,术中出血量更大、手术时间、术后住院时间更长。而对于合并胎盘植入的患者来说,其术中出血量、手术时间及术后住院时间均最高/长。提示凶险性前置胎盘合并胎盘植入将加重产妇生产负担,威胁其生命安全。

胎盘是血供最为丰富的器官之一,胎盘血管生长及分化调控直接关系到孕期胎盘的发育,VEGF可直接刺激血管内皮细胞移动、增殖及分化,增加微血管通透性,促进体内新生血管形成[12]。sFlt-1可与VEGF相结合,抑制其生物活性,正常妊娠过程中,VEGF与sFlt-1维持平衡,以确保胎盘的正常生长,而异常血管的形成可导致蜕膜发育不良,滋养层过度侵袭,进而形成胎盘植入[13]。

本研究发现,观察组-1(凶险性胎膜前置合并胎盘植入)、观察组-2(凶险性胎盘前置无胎盘植入)患者及对照组间,血清VEGF水平无明显差异,但血清sFlt-1水平差异明显,与对照组比较,观察组血清sFlt-1水平明显升高,且伴胎盘植入的观察组-1血清sFlt-1水平更高。此外,根据胎盘植入深度,将观察组-1分为A(黏连性胎盘)、B(植入性胎盘)、C(穿透性胎盘)3组,比较发现,不同植入深度患者血清VEGF水平无明显差异,但随着植入深度的加深,患者血清sFlt-1水平呈上升趋势。以上发现说明,血清sFlt-1浓度升高在提示前置胎盘及胎盘植入中具有良好价值。

采集胎盘组织进行Real-time ROC检测被研究者胎盘组织VEGF mRNA及sFlt-1 mRNA水平发现,观察组与对照组胎盘组织VEGF及sFlt-1 mRNA表达水平与其血清浓度一致,观察组及对照组VEGF mRNA表达量无显著性差异,但观察组胎盘组织sFlt-1 mRNA表达量显著高于对照组,且随着胎盘植入深度的加深,胎盘组织sFlt-1 mRNA表达量逐渐上升,VEGF/sFlt-1失衡越严重。有学者发现[14],胎盘植入母体血清VEGF浓度降低,sFlt-1浓度上升,本研究中,胎盘植入母体中血清VEGF浓度及胎盘组织中VEGF mRNA表达量与对照组无明显差异,可能与本文研究样本量过小有关,但sFlt-1改变趋势与上述研究结果一致。

以上研究结果提示,胎盘前置及胎盘植入均与血管内皮生长因子表达异常密切相关。既往研究表明[15],胎盘植入将造成底蜕膜内多核巨噬细胞数量减少,多核巨噬细胞减少后,其所分泌的VEGF也对应减少,而sFlt-1表达上升可被视为对血管生成减少的直接性反馈,也可能是为满足胎儿生长代谢的代偿机制。

综上所述,凶险性前置胎盘患者胎盘植入风险更高,而胎盘前置与胎盘植入与血管内皮生长因子作用异常密切相关,凶险性胎盘前置合并胎盘植入患者胎盘组织中sFlt-1表达量上升,母体血清sFlt-1浓度也异常升高,VEGF/sFlt-1失衡可有效提示胎盘植入。