基于网络药理学探讨银杏叶抗肝癌的作用机制①

滕 杨,刘玉双,周海瑞,张 杰,焦淑清,倪 蕾

(佳木斯大学,黑龙江 佳木斯 154007)

肝癌(hepatocellular carcinoma)作为全球最普遍的实体器官恶性肿瘤之一,分为原发性性肝癌和继发性肝癌[1]。具有初期确诊艰难、进展快、手术后危险因素大[2]和预后差的特点,所以对肝癌进行一级预防以及寻找新的治病药物是当下的研究热门。中药作为综合性医治的核心构成部分具备与众不同的医治优点[3],不但能抑制肝癌细胞分化,加快肝癌细胞的凋亡[4],同时也能够抑制肝癌细胞的侵扰和迁移,提升肝癌病人的免疫能力、改善肝癌细胞的多药耐药,实现了从多层次、多环节、多途径、多靶点发挥抗肝癌的作用[5]。

银杏叶为银杏科植物银杏(ginkgo biloba L.)的干燥叶[6],所含的关键化学成分有黄酮类(flavonoids)、萜类(terpenes)、银杏醇(ginnol)、莽草酸(shikimic acid)等。据《食疗本草》记述,银杏叶味淡,微辛,甘、苦、涩、平,入心肺功能经[7,8]。可用于敛肺止喘、活血化瘀、活脉止痛、化浊降血脂[9],还有保护肝脏,促使肝脏机能充分发挥的特殊功效[10]。本研究主要是采用网络药理学的方法预测出银杏叶治疗肝癌的有效活性成分、核心作用靶点,进行GO和KEGG通路富集分析,再通过分子对接的方法模拟化合物与疾病靶点间的结合活性,为银杏叶抗肝癌作用机制提供了一定的理论依据,并为中药治疗肝癌提供参考思路。

1 数据库与软件

1.1 数据库

TCMSP数据库(http://tcmspw.com/tcmsp.php);UniProt数据库(https://www.uniprot.org/);Pubchem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/);SwissTargetPrediction数据库(http://www.swisstargetprediction.ch/);Drug Bank数据库(https://www.drugbank.ca/);OMIM数据库(http://www.omim.org/);Genecards数据库(https://www.genecards.org/);Metascape分析平台(https://metascape.org/);Cytoscape分析平台(https://www.cytoscape.org/);STRING分析平台(https://string-db.org/);微生信平台(https://string-db.org/)。

1.2 软件

Auto Dock Tools软件(https://autodock.scripps.edu/);PyMOL软件(https://pymol.org/2/)。

2 实验方法

2.1 银杏叶作用靶点以及肝癌疾病靶点的筛选

筛选标准:DL≥0.18、OB≥0.30[11],使用TCMSP数据库,以银杏叶为搜索词,筛选出其活性成分,在Swiss Target Prediction数据库中查找对应的靶点。同时,在Uniport数据库中限定物种为人类,选择已验证过的靶点基因,除去没有靶点和重复的活性成分。通过DrugBank、OMIM、Genecards三个疾病靶点数据库得到HCC相关靶点,导入Uniport,再次选择人类物种和以验证过的蛋白,删去重复值得到疾病靶点数据库。

2.2 药物-疾病-靶点的确定

将银杏叶和疾病靶点导入Venny 2.1.0分析平台,得到78个共同靶点并绘制Venn图。

2.3 核心网络的确定以及蛋白质相互作用网点(PPI)的构建

使用String数据库建立PPI网络,除去游离靶点,通过Cytoscape3.9.1进行可视化,使用软件中“Network Analyzer”来分析成分疾病网络靶点的属性值,计算节点的介度值(Betweenness)来构建PPI网络图。

2.4 成分-疾病-靶点网络的构建

通过整理银杏叶与肝癌相同靶点,得到Network和Type文件,导入Cytoscape3.9.1数据库,节点代表作用靶点、活性成分和疾病,通过改变节点大小,绘制成分-疾病-靶点网络图。

2.5 GO生物过程和KEGG通路富集分析

在String平台查找到的蛋白靶点,以度值>30为条件得到10个核心靶点,将其输入Metascape中,分别对核心靶点进行GO和KEGG分析,将结果导入微生信制作富集气泡图。

2.6 核心活性成分-关键作用靶点分子对接

在Pub Chem数据库下载成分的二维结构并存为SDF文件,使用Chem Bio 3D软件将核心活性成份转化成PDB格式,导入Auto Dock软件将PDB转化成PDBQT;在PDB数据库下载关键靶点蛋白的3D结构并保留为PDB文件;用PyMOL软件去掉水分子和配体。将处理好的的关键靶蛋白储存为PDB格式导入Auto Dock软件,对分子进行常规化处理并进行分子对接,最终用PyMOL进行对接结果可视化。

3 实验结果

3.1 银杏叶活性化学成分与作用靶点汇总以及肝癌疾病靶点筛选

使用TCMSP数据库并根据OB值和DL值筛选得到可以进行研究实验的活性成分10种(YXY1-YXY10),主要含有木犀草素-4'-葡萄糖苷、丁香素和芝麻素等,银杏叶有效成分汇总见表1。在DrugBank、OMIM、Genecards三个疾病靶点数据库中筛选疾病靶点,将得到数据输入Uniport数据库对蛋白质进行标准化处理,删去重复靶点名称,得到与疾病相关靶点共1637个。

表1 银杏叶活性有效成分汇总

3.2 药物-疾病交集靶点Venn图

将药物和疾病靶点导入Venny2.1.0平台中,得到交集靶点78个,制作药物-疾病靶点交集图,见图1。

图1 银杏叶活性有效成分基因与肝癌基因Venn图

3.3 核心网络的确定以及蛋白质相互作用网点(PPI)的构建

将药物-疾病交集靶点导入String平台中,设置置信度≥0.4,删去两个无蛋白作用靶点,构建“YXY-HCC”的PPI网络,将Stv文档导入Cytoscape3.9.1中进行数据分析,得到PPI网络图,按照Betweenness值大小逐一排列,其中蓝色表示相对重要靶点名称,见图2。

图2 银杏叶活性化合物-肝癌疾病共有靶点基因PPI网络

3.4 有效成分-疾病-靶点网络的构建

将成分与疾病相同靶点整理为Network和Type文件,将其导入Cytoscape3.9.1分析平台进行绘图。其中倒三角形表示银杏叶药物,圆形表示银杏叶活性成分,正八边形为肝癌疾病,菱形与长方形为作用靶点,其中颜色深的为核心作用靶点,见图3。

图3 银杏叶活性成分-肝癌疾病-靶点网络图

3.5 核心靶点的GO富集分析和KEGG富集分析

在本研究中,10个核心靶点共得到了30个GO注释和10个KEGG通路,GO分析包括三个子项,分别为生物过程(biological process)、细胞组成(cell component)以及分子功能(molecular function),见图4。此外,使用Metascape数据库进行KEGG信号通路分析,得到79条通路,排名前10通路,见图5。

图4 GO富集分析条形图

图5 KEGG富集气泡图

3.6 分子对接结果分析

选取Degree值排名前三的靶点蛋白作为配体,靶目标蛋白相匹配的活性成份做为化合物开展分子对接,其结合能(Binding energy)结果见表2,分子对接模拟见图6。

图6 分子对接模式图

表2 银杏叶活性成分与肝癌作用靶点的分子对接结果

4 讨论

肝癌的发病机制可能与体重、年纪、自然环境、生活方式、基因遗传等原因相关。中医学的整体观念将身体视作一个复杂系统,疾病是身体作用网络的失调情况。中医学治疗着眼于复杂系统作用的总体调整,调节这一不平衡的网络,使其修复到平衡状态。因而,在中医临床实践活动中,寻找治疗肝癌的合理中药,并分析其作用机制,才有较长远的发展潜力[12]。

本实验通过网络药理学方法及分子对接初步探讨了银杏叶抗肝癌的作用机制,筛选出银杏叶抗肝癌的主要成分为木犀草素-4'-葡萄糖苷、毛莨黄素和芝麻素等10个关键化合物及10个关键靶点、10个相关信号通路,推断出银杏叶可能有抗肝癌的效果。根据GO和KEGG通路富集分析结果确定银杏叶抗肝癌的重要作用通路,去除广泛通路后,重点对“Estrogen signaling pathway”这一通路进行讨论。

雌激素受体(estrogen receptor,ER)包括ERα和ERβ,在1977年首次发现于子宫内膜细胞,随后,人们陆续在肝脏、乳腺、前列腺等器官中发现了ER的表达。ER是一类由配体激活的核转录因子,归属于核受体(nucleus receptor,NR)超家族成员,近些年,雌激素的基因组作用已获得充足确认,对雌激素受体的非基因组作用的探究变成关注的聚焦点,尤其要注意激活磷脂酰肌醇-3-激酶-蛋清丝氨酸、苏氨酸激酶(PI3K/AKT)数据信号通路、转录因子NF-κB与转录激活因子3(STAT3)数据信号通路[13]。

PI3K/AKT数据信号通路、雌激素与肝癌的发生发展趋势PI3K/AKT数据信号通路被认为是肿瘤细胞存活的关键通路,被称作“抗细胞凋亡通路”。由此可见,雌激素能一定程度抑制AKT磷酸化抑制肝癌细胞增殖,ER通路抑制STAT3活性来改变肿瘤的发展趋向,在非雌激素依赖的肿瘤中,炎症因子的含量降低,危害肿瘤的自身免疫,进而形成肿瘤免疫的核心部分,ER通路抑制转录因子NF-κB发挥抗肿瘤功效,通过ER抑制NF-κB活化,既可以抑制下游增殖周期相关分子和基质金属蛋白等肿瘤侵袭相关分子的表达[14],又可以下调抗凋亡基因Bcl-2,肝癌的发病率可以通过雌激素和其信号通路降低,进一步验证雌激素具有抑制肝癌的分子机制。因而,在雌激素存有的情形下,PI3K/AKT信号通路、转录因子NF-κB与STAT3信号通路与肝癌的产生、发展趋势和迁移息息相关,为进一步讨论雌激素激活PI3K/AKT信号通路、转录因子NF-κB与STAT3信号通路在抗肝癌的作用机制奠定一定的理论基础。

综上所述,本研究运用网络药理学结合分子对接手段,从分子层面探讨银杏叶抗肝癌的作用机制,发现银杏叶主要通过影响Estrogen signaling pathway信号通路抑制肝癌细胞,具有多成分、多靶点、多通路治疗肝癌疾病的特点,为后续银杏叶的开发研究提供理论基础。