UPLC-MS/MS法测定米拉贝隆中EDCI

王玉如,卢忠秋,兰公剑

(南京正大天晴制药有限公司,江苏 南京 210046)

米拉贝隆是首个治疗膀胱过度活动症(OAB)的β3-肾上腺素受体激动剂类药物,与治疗OAB的一线药物抗胆碱能药相比,该药安全性较高,具有良好的应用前景[1]。2011年9月在日本首次上市,2012年6月美国食品药品监督管理局(FDA)批准上市[2-4]。米拉贝隆的合成工艺是以2-氨基噻唑-4-乙酸、对硝基苯乙胺盐酸盐和R-扁桃酸为起始物料,经缩合、还原和缩合等反应生成,在缩合工艺中用到1-乙基-3(3-二甲基丙胺)碳二亚胺(EDCI)缩合剂,含有碳二亚胺类遗传毒性警示结构[5]。遗传毒性杂质是指在微量的水平下能诱导DNA发生突变的杂质,具有潜在的致癌性,威胁人类的健康[5-8],已被广泛关注及严格控制。因此有必要建立一种米拉贝隆中EDCI的检测方法。目前国内外关于EDCI检测的研究较少,对米拉贝隆中EDCI的测定未见报道[9-10]。根据国际药品注册技术协调会议(ICH)M7、美国FDA、欧洲EMA和中华人民共和国药典(四部)关于基因毒性杂质的指导原则等要求[11-13],遗传毒性杂质的毒理学关注阈值(Threshold of Toxicological Concern,TTC)为1.5 μg/d。米拉贝隆缓释片最大日剂量为50 mg,所以米拉贝隆中EDCI的限度为30 mg/kg,限度较低,且该杂质紫外吸收较弱,采用普通液相色谱方法满足不了灵敏度要求。液相色谱-质谱联用技术具有灵敏度高、分析速度快及结果准确可靠等特点[14-16],可以满足痕量杂质检测的要求。本研究首次建立了超高效液相色谱串联质谱法(Ultra High Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry,UPLC-MS/MS),可准确、灵敏地测定米拉贝隆原料药中基因毒性杂质EDCI的残留量。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

1290超高效液相色谱仪(安捷伦科技有限公司);6470三重四极杆质谱仪(安捷伦科技有限公司);MSA6.6S电子分析天平(赛多利斯-上海贸易有限公司);ME802E电子分析天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司);XSE205DU 电子分析天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)。

1.2 试药

乙酸铵(LC/MS级别,上海安谱科技有限公司);乙腈(HPLC级,默克股份有限公司);EDCI对照品(批号:MB20060501,纯度:99.8%,苏州昊帆生物股份有限公司);米拉贝隆原料药(批号:144190601、144190602、144190603,南京正大天晴制药有限公司)。

2 方法与结果

2.1 方法条件

2.1.1 色谱条件

液相色谱柱Agilent ZORBAX Bonus-RP(150×4.6 mm,3.5 μm);流动相A为10 mmol/L乙酸铵溶液,流动相B为乙腈;流速1.0 mL/min;柱温35 ℃;进样体积10 μL;流动相梯度见表1,六通阀切换设置:6 min设置进入废液。

表1 流动相梯度

2.1.2 质谱条件

电喷雾离子源(Electrospray Ionization Source,ESI); 采用多反应监测(Multiple Reaction Monitoring,MRM)模式,正离子模式检测;EDCI离子对及相关参数见表2。离子源参数:干燥气温度300 ℃;干燥气流速5 L/min;鞘气温度250 ℃;鞘气流速11 L/min;雾化器压力45 psi;喷嘴电压500 V;毛细管电压3 500 V。

表2 EDCI离子对及相关参数

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品贮备液

取EDCI对照品适量,精密称定,置量瓶中,用溶剂[V(乙腈)∶V(水)=50∶50]溶解并定量稀释制成每1 mL约含300 ng的溶液,作为对照品贮备液。

2.2.2 对照品溶液

精密量取对照品贮备液适量,用溶剂[V(乙腈)∶V(水)=50∶50] 定量稀释制成每1 mL约含30 ng的溶液,作为对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液

取米拉贝隆约10 mg,精密称定,置10 mL量瓶中,用溶剂[V(乙腈)∶V(水)=90∶10]溶解并定量稀释至刻度,摇匀,即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性试验

分别精密量取溶剂[V(乙腈)∶V(水)=50∶50]、对照品溶液和供试品溶液(批号:144190601)各10 μL,按照上述色谱条件和质谱条件进行试验,记录色谱图,试验结果见图1。溶剂和供试品溶液均不干扰EDCI的测定,表明本方法的专属性良好。

图1 专属性试验TIC色谱图

2.3.2 线性关系试验

精密量取“2.2.1”项对照品贮备液适量,分别用溶剂[V(乙腈)∶V(水)=50∶50]溶解并定量稀释制成每1 mL约含3.0,15,24,30,45,60 ng(10%～200%限度浓度)的系列浓度的线性溶液,取各浓度的线性溶液,按“2.1”项下方法条件进样,以EDCI的浓度为横坐标(x),以EDCI的峰面积为纵坐标(y),进行线性回归。回归方程为:y=2 291.027 6x+1 295.825 1,r= 0.999 8。结果表明,EDCI在质量浓度3.03～60.56 ng/mL范围内,线性关系良好。

2.3.3 定量限与检测限试验

取“2.2.1”项对照品贮备液适量,用溶剂[V(乙腈)∶V(水)=50∶50]逐步稀释,分别稀释至信噪比S/N≥10为定量限溶液;至信噪比S/N≥3为检测限溶液。结果该方法下EDCI的定量限质量浓度为0.18 ng/mL(相当于供试品质量浓度的0.18×10-6);平行测定6次峰面积RSD为5.2%(n=6);检测限质量浓度为0.06 ng/mL(相当于供试品浓度的0.06×10-6),结果表明,定量限浓度明显低于限度浓度的10%(3.00×10-6),方法灵敏度较好,符合检测要求。

2.3.4 准确度试验

取米拉贝隆样品(批号:144190601)10 mg,精密称定9份,置10 mL量瓶中,用溶剂[V(乙腈)∶V(水)=50∶50]溶解,精密加入“2.2.1”项下对照品贮备液各0.50,1.00和1.50 mL,分别用溶剂稀释至刻度,摇匀,作为50%回收率溶液、100%回收率溶液和150%回收率溶液;每个浓度水平平行配制3份。按“2.1”项下方法条件检测,结果表明,采用外标法计算,不同浓度水平,EDCID的回收率在83.43%～90.62%,满足70%～130%的验证要求,RSD为3.2%(n=9),表明该方法的准确度良好,见表3。

表3 准确度试验

2.3.5 进样精密度试验

取“2.2.2”项下对照品溶液,连续进样6针,记录峰面积,结果峰面积的RSD为1.0%(n=6),保留时间RSD为0.1%(n=6),表明该仪器进样精密度良好。

2.3.6 重复性试验

取米拉贝隆样品(批号:144190601)10 mg,精密称定6份,置20 mL量瓶中,用溶剂[V(乙腈)∶V(水)=50∶50]溶解,分别精密加入“2.2.2”项下对照品贮备液1.00 mL,用溶剂稀释至刻度,摇匀,作为重复性溶液。依法测定,结果EDCI含量的RSD为2.2%<10%(n=6),表明该方法重复性良好。

2.3.7 中间精密度试验

不同的分析人员在不同日期进行重复性试验,照“2.3.6重复性”项下方法重新配制对照品溶液和6份加标供试品溶液,测定加标供试品溶液中杂质的含量,与重复性试验结果计算12次测量结果的RSD。结果EDCI含量的RSD为3.8%(n=12),表明该方法中间精密度良好。

2.3.8 溶液稳定性

按照“2.2.2”和“2.2.3”项下溶液配制方法,分别配制对照品溶液和供试品溶液,在室温条件放置0,4,10,14,16和19 h后测定,结果对照品溶液峰面积与0 h比值均介于79.5%～94.0%,供试品溶液中均未检测出EDCI,结果对照品溶液和供试品溶液室温放置19 h内稳定。

2.4 样品测定

取3批样品(批号:144190601、144190602、144190603),按“2.2.3”项下溶液配制方法配制供试品溶液,按“2.1”方法条件进样测定,采用外标法以峰面积进行计算,3批米拉贝隆中均未检测出EDCI。

3 结论

实验采用了不同流速(0.9,1.0,1.1 mL/min),不同的柱温(30,35,40 ℃)及不同的有机相比例(3%,5%,7%),结果表明,适当微调系统参数,对EDCI的测定均无影响。本方法具有专属性良好、线性范围宽、准确度良好和灵敏度高等特点,可用于米拉贝隆中EDCI的测定。