大蒜抑菌性能及稳定性研究

高晓娟,张俊娇,刘光鹏,曲艳萍,李红翠

(1.齐鲁理工学院 生物与化学工程学院,山东 济南 250200;2.中华全国供销合作总社 济南果品研究院,山东 济南 250200)

1 实验材料和方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料

大蒜:市售,无芽,无虫变,于冰箱保存。

指示菌种(由齐鲁理工学院微生物学实验室提供):

有害指示菌:大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、黑曲霉、毛霉;

有益指示菌:乳酸杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、地衣芽孢杆菌。

1.1.2 主要试剂

蛋白胨、牛肉膏、琼脂粉、氯化钠、酵母浸粉、MRS培养基、溴甲酚绿乙醇溶液、乙酸钠、蔗糖、硫酸镁、硫酸锰、磷酸氢二钠、柠檬酸等生物试剂。

1.2 主要仪器设备

高压蒸汽灭菌锅(YXQ-LS-SⅡ型,上海博讯实业有限公司医疗设备厂)、单人超净工作台(SW-CJ-1D型,苏州净化设备有限公司)、隔水式恒温培养箱(GNP-9080型,上海精宏实验设备有限公司)、电热恒温水温箱(HHW.21型,北京永光明医疗仪器厂)。

1.3 实验方法

1.3.1 大蒜汁制备

大蒜,去皮,于榨汁机中榨成汁,再于离心机中3 000 r/min离心20 min,取上清液作为原液。

1.3.2 供试菌悬浮液制备

分别取大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、地衣芽孢杆菌斜面菌种于50 mL LB液体培养基内,取乳酸杆菌于50 mL BCG牛乳液体培养基内,取保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌于50 mL MRS液体培养基内,取黑曲霉、毛霉菌于50 mL PDA液体培养基内,分别于37和30 ℃摇床培养24～48 h。

1.3.3 不同条件下抑菌实验

因老白皮大蒜是日常生活中较为常见的大蒜品种,因此,1.3.3.1～1.3.3.6的实验均选用老白皮大蒜汁进行。

1.3.3.1 抑菌预实验

采用管碟扩散法[12]:无菌条件下,分别取100 μL细菌菌悬液和霉菌菌悬液于无菌LB培养基和PDA培养基平板中,涂布均匀备用。用无菌镊子夹取无菌牛津杯放于上述培养基表面,使其与培养基尽量接触。分别取200 μL大蒜汁于牛津杯中,同时用无菌水做对照实验。完成上述操作后,将培养皿分别放入37和30 ℃恒温培养箱中培养24～48 h后取出,测量每个抑菌圈直径。4种有害指示菌按上述标准操作,同时做4组平行实验。

1.3.3.2 大蒜汁浓度抑菌影响实验

采用二倍稀释法:用生理盐水把大蒜汁稀释成浓度为50%,25%,12.5%,6.25%的大蒜汁稀释液,按照1.3.3.1中的方法,测定不同浓度大蒜汁的抑菌效果。

1.3.3.3 pH值对大蒜汁抑菌影响实验

实验采用滤纸片扩散法,分别移取pH值为2.6,3.6,4.6,5.6,6.6,7.6的磷酸缓冲液各4 mL,与等量大蒜汁原液混合均匀,用无菌镊子夹取在不同pH值大蒜汁中浸泡5 min后的滤纸片,分别放在4种有害指示菌平板上。同时,用无菌水做对照实验,恒温培养后,测量抑菌圈直径,观察pH值对大蒜汁抑菌效果的影响。

1.3.3.4 温度对大蒜汁抑菌影响实验

宋军霞等[13]人研究发现,在一定范围内,随着热处理温度升高,大蒜汁抑菌作用逐渐增强,但当超过一定温度后,大蒜汁抑菌作用逐渐减弱甚至失去抑菌活性。实验采用管碟扩散法,取6支试管各取4 mL大蒜汁,分别放入35,45,55,65,75 ℃的恒温水浴锅中进行热处理,处理时间为30 min,按1.3.3.1中的方法观察温度对大蒜抑菌效果的影响。

1.3.3.5 储存时间对大蒜汁抑菌影响实验

将老白皮大蒜汁原液在室温下避光保存,以大肠杆菌和金黄色葡萄球菌为指示菌,每间隔一天做一次抑菌实验,连续5 d,按照1.3.3.1中的方法测定抑菌圈直径大小,观察储存时间对大蒜汁抑菌效果的影响。

1.3.3.6 大蒜汁对环境微生物的抑制实验

该实验采用自然沉降法:分别取6个无菌LB和PDA固体培养基平板,放在实验台上,打开皿盖,3个LB培养基表面上喷上老白皮大蒜汁,另三个喷上无菌水做对照实验。6个PDA培养基作同样处理,过夜后,盖上皿盖,置于恒温培养箱中倒置培养24～48 h,观察培养皿内微生物生长情况。

1.3.3.7 不同类型大蒜抑菌效果的影响实验

实验选用新鲜紫皮大蒜、新鲜白皮大蒜、老紫皮大蒜、老白皮大蒜4种不同类型大蒜汁,分别在37和70 ℃水浴处理30 min后,研究不同温度下不同类型的大蒜对不同类型微生物的抑制效果。

抑菌实验采用滤纸片扩散法:取20 μL不同类型的大蒜汁于无菌滤纸片上,晾干后放于不同指示菌的固体培养基平板中,轻压滤纸片,使其贴合在培养基上。同样操作,用无菌水做对照实验。37 ℃恒温培养,48 h后用直尺测量抑菌圈直径。

2 结果与分析

2.1 大蒜汁对不同微生物的抑菌效果

对4种典型有害指示菌的抑菌预实验,实验结果如表1和图1所示。

图1 大蒜汁对4种指示菌的抑菌结果图

表1 大蒜汁对4种有害指示菌的抑菌效果

实验结果如表1和图1所示:大肠杆菌的抑菌圈最大,说明大蒜汁对其抑制效果最好;对金黄色葡萄球菌的抑制效果次之,但是抑菌圈明显;黑曲霉和毛霉的抑菌圈较小;因此,通过实验证明大蒜汁对细菌的抑菌效果更显著。

2.2 大蒜汁浓度对抑菌效果的影响

4种浓度对4种有害指示菌的抑菌结果如图2所示:大蒜汁的浓度越高,对4种微生物的抑菌效果越好,浓度越低,抑菌效果显著降低。不同浓度的大蒜汁对大肠杆菌的抑菌作用强于金黄色葡萄球菌、黑曲霉和毛霉;对毛霉的抑制效果最弱,当浓度降到25%时,就没有明显抑菌圈;浓度降到12.5%时,黑曲霉无明显抑菌圈,但与对照组相比,大蒜汁周围的霉菌孢子的生成量及菌丝浓度明显降低。

图2 不同浓度大蒜汁对指示菌抑制效果

2.3 不同pH值对大蒜汁抑菌效果的影响

利用缓冲液对大蒜汁进行pH值调整后再进行的抑菌实验,结果由图3可以看出,随pH值的升高大蒜汁对于细菌的抑制效果呈现出先降低再升高再降低的趋势,说明酸性条件下,大蒜对于细菌抑制效果较强;而对于霉菌呈现出先降低后升高的趋势。可在后续研究中,继续升高pH值,观察碱性条件下对霉菌的最佳抑制pH值。

图3 不同pH值大蒜汁对指示菌抑制效果

2.4 温度对大蒜汁抑菌效果的影响

利用不同温度热处理的大蒜汁对4种有害指示菌的抑菌效果不同,实验结果如图4所示。当温度高于35 ℃时,抑菌效果明显减弱,温度越高抑菌效果越弱。通过实验可以确定最适抑菌温度是35 ℃。当处理温度高于55 ℃时,处理后的大蒜汁对黑曲霉和毛霉的抑菌实验,没有明显抑菌圈;被75 ℃处理后,大蒜汁对金黄色葡萄球菌没有明显抑菌圈现象。这说明当温度高于75 ℃甚至更高时,大蒜汁的抑菌活性基本消失,这可能是由于高温破坏了大蒜中的抑菌活性成分而失去抑菌活性。后续实验可以增加低温到35 ℃之间的温度梯度,研究低温对抑菌效果的影响。

图4 不同温度下处理过的大蒜汁对指示菌抑制效果

2.5 储存时间对抑菌效果的影响

不同储存时间的大蒜汁对指示菌的抑制结果如图5所示,实验结果说明,随着储存时间的增加,大蒜的抑菌效果逐渐减弱,在存储5 d后,检测不到抑菌圈。

图5 大蒜汁的储存时间对指示菌的抑制效果

2.6 大蒜汁对环境微生物的抑制效果

通过培养喷洒大蒜汁与无菌水的培养基平板后,实验结果如图6和图7所示,两图中上层平板为喷有大蒜汁的实验组,下层平板为无菌水的对照组。对比结果可以明显看出,在喷有大蒜汁的平板上微生物菌落较少,对照组平板上微生物的长势明显,所以大蒜汁对环境中的微生物具有明显的抑制作用。

图6 PDA培养基菌落生长情况

图7 LB培养基菌落生长情况

2.7 不同类型大蒜的抑菌效果

37和70 ℃水浴处理后的不同大蒜汁对不同微生物进行的抑菌实验结果如表2和表3所示。

表2 37 ℃下大蒜液对不同指示菌的抑菌效果

表3 70 ℃下大蒜液对不同菌种的抑菌效果

实验结果说明,37 ℃大蒜汁对5种指示菌均有显著抑制效果,其中,4种不同类型的大蒜均对大肠杆菌的抑制效果最显著,老紫皮大蒜的抑菌效果最好,新鲜白皮大蒜的抑菌效果最弱;对益生菌中的地衣芽孢杆菌和保加利亚乳杆菌的抑制效果更强;70 ℃大蒜汁对指示菌的抑菌效果较弱,高温使大蒜的抑菌活性降低,通过比较实验数据可以看出,大蒜对有害菌的生长影响比对有益菌的生长影响要大。

3 结论

通过实验结果可知,大蒜对细菌的抑制效果要强于霉菌;不同浓度的大蒜汁对微生物的抑制效果不同,浓度越高,抑菌效果越明显;不同pH环境,大蒜抑菌效果不同,在偏酸性环境中对指示细菌抑制效果更好,在偏酸或偏碱条件下对指示霉菌抑制效果较好;通过热处理实验说明,温度超过35 ℃以后,随着温度的升高,大蒜的抑菌活性逐渐降低甚至消失;大蒜汁随着储存时间的增加,抑菌效果逐渐减弱;通过研究大蒜对腐败微生物的生长影响,可为大蒜在食品防腐保鲜中的应用提供指导。

通过研究大蒜对乳酸杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、地衣芽孢杆菌4种益生菌的影响,结果表明,大蒜对益生菌具有一定抑制效果,尤其是对保加利亚乳杆菌和地衣芽孢杆菌的抑制效果较强,建议人们在食用含有益生菌保健品或食品时,尽量减少大蒜的摄入,尤其是减少生食老紫皮大蒜。若必须摄取大蒜,可通过食用加热处理后的大蒜,并在摄取大蒜后立即饮水,使肠胃中的大蒜得到适当的稀释,以减少大蒜对益生菌生长的抑制,使得补充益生菌的作用得到最大发挥。