脑性瘫痪生物标志物的研究进展

刘 宇，宋福祥

（1.佳木斯大学 a 康复医学院* 护理学院 b 儿童神经康复实验室，黑龙江 佳木斯 154007 ；2.深圳市龙华区妇幼保健院，广东 深圳 518000）

脑性瘫痪（cerebral palsy，CP）简称脑瘫，是由大脑发育不成熟、先天性发育缺陷或损伤等非进行性脑损伤引起的一组持续存在的中枢性运动和姿势发育障碍、活动受限的症候群[1]。我国目前1 ～6岁儿童脑瘫的患病率为2.46‰[2]，国外的患病率为1.4‰～3.2‰[3-5]。目前，已有很多证据表明早期干预可以有效改善脑瘫患儿的预后。但当前的早期诊断主要是基于神经系统检查以及运动功能评估。为了能够更准确、更早地诊断脑瘫，越来越多的研究人员关注到生物标志物的筛查。通过生物标志物检测进行早期诊断，并给予脑瘫患儿早期干预和治疗，可改善其预后。生物标志物是指具有“一种可客观检测和评价的特性，可作为正常生物学过程、病理过程或治疗干预药理学反应的指示因子”。寻找和发现有价值的生物标志物已成为当前医学领域的研究热点。生物标志物对疾病的早期诊断及干预策略的制定至关重要。本文总结了目前脑瘫生物标志物以及针对这些生物标志物发展的检测技术，以期为脑瘫的提早发现及早期干预提供指导。

1 生物标志物

1.1 遗传基因

目前越来越多的证据表明，10% ～30% 的脑瘫儿童可以确定潜在的遗传病因[6]。脑瘫低风险婴儿也应该进行遗传病理学筛查，如没有先天性出生缺陷的足月儿[7]。通过全外显子组测序（Whole Exome Sequencing，WES）[8]，研究者报道了三个先前确定的 脑 瘫 基 因（TUBA1A、SCN8A 和KDM5C）及 六个新的候选脑瘫基因（AGAP1、JHDM1D、MAST1、NAA35、RFX2 和WIPI2）可能对脑瘫具有潜在的致病性。最终，在14% 的脑瘫病例中发现了新发和遗传性单核苷酸变异，其中一半在候选基因中，同时确定了5 个基因的变异可能会导致脑瘫的出现，分别为KDM5C、SCN8A、TUBA1A、L1CAM 和PAK3。遗传的异质性突出了遗传对脑瘫影响的复杂性，需要进一步研究来确定这些假定致病性脑瘫基因的致病作用。这些研究突出了下一代测序可提供精确的分子诊断作用，加深了对疾病病理学的理解，为完善遗传机制和预后咨询提供了机会。另外，当前此方法运用越来越多，操作也越来越便捷，希望未来在预测脑瘫方面得到更多的重视。

1.2 DNA 甲基化

DNA 甲基化是一类发生在胞嘧啶5 号位碳原子上，可以通过改变基因和蛋白质的表达水平来稳定遗传的表观修饰。表观遗传学在改变基因表达以应对细胞压力或疾病方面具有关键作用[9]。Mohandas 等[10]研究指出，同卵双胞胎之间脑瘫患病率的差异可能与DNA 甲基化改变有关，通过研究共鉴定出190 个差异甲基化基因，其中脑瘫组37 个基因高甲基化，其余153 个基因低甲基化。另一项研究检测了同卵双胞胎新生儿期血液中的DNA 甲基化，发现与脑瘫有关的多个基因胞嘧啶的CpG 位点有甲基化变化。差异甲基化的关键CpG 位点是HNRNPL、RASSF5、CD3D 和KALRN。Bahado-Singh 等[11]为评估脑瘫儿童血液样本中的DNA 甲基化，以及研究潜在的表观遗传生物标志物以预测脑瘫，进行了全基因组DNA 甲基化分析，使用人工智能平台分析了23 名脑瘫病例和21 名正常儿童的新生儿期血液DNA 甲基化情况，发现258个基因中有230 个显著差异的甲基CpG 位点，对新生儿脑瘫的预测具有95% 的敏感性和94.4% 的特异性。说明使用人工智能平台技术分析血液表观遗传变化似乎可以准确预测脑瘫，缺点是样本量不足。现阶段，有关DNA 甲基化的研究仍有局限性，如难以获得早期血液样本、样本来源者的年龄较大、样本量较小，以及一些研究的重点是痉挛型脑瘫等。未来的研究目标之一是开发系统的方法和数学模型，在出生时筛选受试者。此外，需要对更广泛的脑瘫分型以及来自其他神经运动和发育状况受试者的样本进行分析。

1.3 miRNAs

microRNAs（miRNAs）是 一 种 微 小 的 内 源 性非编码调控RNA，其功能是基因表达的转录后调节，在中枢神经系统的发育和功能表达中发挥重要作用。Chapman 等[12]研究miRNAs 作为脑瘫的潜在生物标志物，证实了通过检测血浆miRNAs 谱预测脑瘫儿童的可能性和潜力。Li 等[13]对脑瘫儿童进行血浆miRNAs 检测，通过qRT-PCR 确定miR-124 的表达，并用荧光素酶试验和Western 印迹法来确认miR-124 对靶基因的调控，结果表明，成熟miR-124 的表达水平在体外被C-T 变异下调了，并且C-T 变异导致的miR-124 减少使得靶基因ITGB1、LAMC1 和BECN1 的抑制效率降低，而这些基因可能在神经系统的发育过程中发挥重要作用。同时，miR-124 表达的减少也与氧化应激下细胞凋亡诱导因子的核转位增加有关，从而诱发更多的细胞凋亡。最终结果表明，pri-miR-124-1 的一个功能多态性可能通过干扰miR-124 的产生而导致儿童脑瘫的遗传易感性，进而干扰miR-124 靶基因的表达和功能。相关研究证明了miRNA 编码区的核苷酸变异与儿童脑瘫易感性之间的关系，显示出miRNAs 作为生物标志物在预测脑瘫方面的潜力。在过去的几年中，医学领域关于miRNAs 在大脑中的作用发表了大量的研究，作为基因表达的转录后调控因子，miRNAs 在大脑发育过程中无疑扮演着至关重要的角色，然而界定它们对发育和受伤大脑影响的研究仍处于初级阶段。鉴于特定的miRNAs 在发育过程中可以表现出不同的功能作用，并且可以发挥协同作用，因此很难确定它们的精确功能和作用，这是在考虑将特定的miRNAs 作为生物标志物预测脑瘫时需要注意的问题。

1.4 营养信号通路NTRK2（trkB）和FGFR1 的转录

转录分析能帮助我们了解细胞或生物体基因组的功能，同时揭示细胞或组织的分子成分，用于了解儿童发育和疾病。转录组由基因组产生的一整套RNA转录本组成，这使我们能够将其与功能蛋白质的表达联系起来。转录组学现已被用于研究广泛的神经系统疾病，调查疾病的病因生理学和潜在的生物标志物，包括阿尔茨海默氏病、孤独症谱系障碍和脑瘫[14]等。目前，关于转录组与脑瘫的研究还较少。Van 等[14]对182 名脑瘫儿童的大规模分析发现，营养信号通路的转录失调是脑瘫的主要扰动之一，特别强调NTRK2（trkB）和FGFR1 的下调。他们将这些与脑源性神经营养因子、成纤维细胞生长因子信号通路以及炎症标志物的上调联系起来，认为这是导致脑瘫中神经元保护能力下降的原因。同时有另一种解释是，营养信号通路的下调可能是由子宫内或产后早期的慢性压力造成的。识别这种分子异常的环境和遗传触发因素，将是理解脑瘫和其他神经发育障碍的病因以及预测那些风险更大疾病的重要一步。但这项研究存在一定的局限性，其使用的细胞系来自外周血，不能像在大脑中观察到的那样概括所有的变化，但仍能为脑瘫潜在的神经化学研究提供宝贵的见解。通过对脑瘫的转录变化进行了大规模的分析研究，证明了临床不同脑瘫中存在趋同分子异常，为未来基因组和功能分析中进一步研究基因的优先排序提供了基础。

1.5 白细胞介素-6（IL-6）和白细胞介素-8（IL-8）

当感染引发下游代谢途径时，会释放各种炎症生物标志物，如细胞因子、白细胞介素（IL）和其他分子。炎症过程的生物标志物与有害的神经学结果有关，如孤独症谱系障碍和神经发育障碍[15]。研究表明，炎症生物标志物与脑瘫的发生风险直接相关。在小鼠模型中，当胎儿暴露在细菌内毒素中导致全身炎症反应时，其对缺氧损伤的易感性增加[16]。据报道，母亲的宫内炎症与婴儿的脑瘫风险增加有关[17]。Gomez 等[18]测量了早产或胎膜早破新生儿胎儿时期羊水和血浆中IL-6 的浓度，发现出现严重新生儿疾病的新生儿（包括脑瘫前兆室周白斑）其胎儿时期血浆IL-6 的浓度高于未出现严重新生儿疾病的新生儿。有学者研究证实，IL-6、IL-8 水平升高和组织学胃底炎的证据与3岁时发生脑瘫的概率增加呈独立相关。这项研究表明，由于羊膜腔内感染而出现的胎儿全身炎症与脑瘫有很强的相关性。据报道，患有新生儿脑病的婴儿脑脊液和血浆细胞因子水平升高[19]，包括那些后来出现神经预后不良的婴儿。进一步的研究显示，在围产期窒息或新生儿脑病的婴儿中发现脐带血IL-6 水平升高[20]。与此相反，早产儿脐带血IL-8、IL-1β 和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）水平与脑瘫患儿的预后没有明显的关联[21]。此外，脑瘫风险或长期神经发育结果不良与脐带血中中枢神经特异性蛋白（S100β）、神经元特异性烯醇化酶的浓度没有显著相关性[22]。最近的一项系统综述提出了脑瘫儿童的神经发育结果与全血、血浆、血清、脑脊液或尿液中的炎症生物标志物之间的关联证据[23]。大多数研究报告了最初几年的神经系统损伤与外周炎症之间的关系。神经系统发育异常与较高的细胞因子循环水平有关，包括IL-1β、IL-6、IL-8 和TNF-α[24]，增加了脑瘫的发生风险。极端早产儿产后2 周内TNF-α、TNF-α 受体-1、IL-8 和细胞间黏附分子-1 的反复升高也与脑瘫发生风险的增加有关[25]。此外，内源性红细胞生成素也与极端早产儿脑瘫的发生有关[26]。在儿童出生时通过检测血液、尿液或脑脊液中的炎症生物标志物，可能有助于早期诊断和干预脑瘫。目前，生物标志物检测被认为是准确及早期诊断脑瘫的关键，但仍缺乏能够一致识别脑瘫儿童的生物标志物，故现阶段对于生物标志物的寻找还在进行中。

1.6 代谢组学生物标志物

代谢组学的研究重点是生物系统中的代谢途径，重点是代谢物[27]。由于脑瘫发病机制的复杂性，目前文献中关于脑瘫代谢标志物的研究资料较少。通常研究对象为围产期窒息和缺氧缺血性脑病（hypoxicischemic encephalopathy，HIE）新生儿，以确定反应预后的生物标志物。一维核磁共振波谱成像显示，与对照组相比，围产期窒息和HIE 婴儿脐血中与能量相关的代谢物发生了显著变化[28]。严重HIE 病例的代谢物中琥珀酸和甘油增加，酮类、丙酮和3- 羟基丁酸减少。酮类的减少和琥珀酸的增加可能意味着新生儿能量的不断消耗和向无氧代谢的转变。高危新生儿脐带血的代谢组分析显示，与对照组新生儿相比，高危新生儿脐带血中胆碱、脯氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸、葡萄糖的水平较低，苯丙氨酸和瓜氨酸的水平较高[29]。同样，在低出生体重的新生儿中，通过检测脐带血中苯丙氨酸和色氨酸等必需氨基酸的水平能够准确区分胎儿生长受限和正常生长的胎儿[30]。HIE 的病理生理机制是多因素且十分复杂的，代谢组学是对代谢物的系统评价，提供了其相互作用的证据。由于缺氧会抑制有氧能量代谢，而有氧能量代谢是全身代谢的核心，因此代谢组学为发现HIE 的生物标志物和疾病的发病机制提供了强大的系统生物学方法。近些年的几项研究已经使用代谢组学来评估动物模型的围产期窒息，但缺乏将代谢图谱与围产期窒息和HIE 的分子病理学知识结合起来的人体研究。当前，对代谢组学生物标志物的研究有助于进一步深入了解脑瘫的复杂病理生理学，同时确定脑瘫的预测性生物标志物。

2 小结

脑瘫是我国儿童肢体残疾的主要致病因素之一。大量研究已经表明通过早期干预及治疗能够改善脑瘫儿童及脑瘫高风险状态儿童的预后，因此脑瘫的早期诊断和干预至关重要。生物标志物检测是临床诊断早期脑瘫的方法之一，但目前国内有关生物标志物的研究较少，尤其是脑瘫领域用于早期预测/ 诊断的生物标志物仍有待研究和明确。在国外，关于脑瘫生物标志物的研究逐渐成为热点，陆续有相关生物标志物发现的报道。但现在由于研究尚在试验进展阶段，同时缺乏大样本量的试验数据，以及临床手段的局限等，目前可用于临床实践的生物标志物很少。随着对脑瘫和相关生物标志物的进一步认识，相信未来会出现更多、更大样本量的试验，使脑瘫生物标志物真正应用于临床。本文总结了目前已有的关于脑瘫生物标志物的知识和文献，希望未来在研究人员的持续努力下，我们能对这种复杂的疾病有更多的了解，给予脑瘫儿童及脑瘫高风险状态儿童早期诊断和干预，充分利用生物标志物的作用，使患儿获得更好的预后，为患儿、患儿家庭乃至社会带去更多的福音。