EM 富硒酵母菌剂的制备及其在水稻富硒生产中的应用

赵 彪，冯 旭，贺付蒙，徐永清，石齐海，冯艳忠，李凤兰

（1.东北农业大学生命科学学院，黑龙江 哈尔滨 150000；2.黑龙江省农业科学院，黑龙江 哈尔滨 150000）

硒是促进植物生长的有益元素，也是人体必需的稀有元素之一[1-2]。合理地摄入硒可有效预防癌症、排毒解毒、抗衰老、提高免疫力和红细胞携氧能力等[3-4]。但人体自身无法合成也不能在体内长期保存硒元素，因此，必须通过膳食摄入补充[5]。我国居民人均硒摄入量为26～32µg∕d，远低于中国营养学会推荐的成人膳食营养素参考摄入量60～250µg∕d[6]。食物中硒元素以无机（亚硒酸钠和硒酸钠）和有机（硒谷氨酸）形式存在，机体对有机硒的利用率高于无机硒[7]。目前，公认最安全、有效和科学的补硒方法为食用富硒农产品[8]。大米作为我国居民的主食之一，其硒元素的含量与居民健康密切相关。因此，促进水稻富硒，进而提高水稻籽粒硒含量，对提高居民健康水平具有重要意义。水稻属于非特异性富硒作物，只能通过外源施加硒元素提高水稻硒积累[9]。

水稻富硒的途径主要有土壤施硒肥、硒肥浸种拌种和叶面施硒肥，但前2 种成本太高。叶面喷施硒肥可有效利用生物富集和转化作用，将不可食用的无机硒转变为有机硒[10]。硒肥分为无机硒肥和有机硒肥，不同形态硒的吸收和转运途径不同，水稻籽粒中以硒代胱∕半胱氨酸和硒代蛋氨酸的有机硒形态存在。研究发现，施用无机硒肥，其在水稻茎叶滞留严重，影响籽粒对硒的吸收，而叶面施有机硒肥可提高籽粒中硒的积累[11-13]。LONG 等[14]研究发现，叶面喷施有机硒可减少硒在水稻其他器官中的累积和滞留，提高籽粒中硒的利用率。微生物肥因具有提供营养、控制病害和改良土壤等附加作用而发展迅猛[15]。不同微生物自身活性物质不同，富硒能力有较大差异。酵母普遍具有强大且稳定的富硒能力，最高富硒量可达4 mg∕g，主要通过高半胱氨酸合酶∕半胱氨酸合酶途径将无机硒转化为高活性的有机硒，是理想的富硒微生物载体[16]。EM（Effective microorganisms）菌是一种包含光合菌、乳酸菌等的复合生物菌剂，具有提高作物品质、减少农药和化肥用量等功效[17]。同时，施用EM 菌肥可显著降低土地管理和肥料成本，提升作物抗逆性和产量[18-19]。目前，关于酵母和EM 菌两者相结合的复合肥研究尚未见报道，更未见其对水稻产量、品质的影响研究。为此，以EM 菌液为发酵液，考察酵母接种量、无机硒质量浓度、发酵温度、发酵时间和pH值对EM 富硒酵母菌剂有机硒质量浓度的影响，并通过响应面法优化发酵工艺条件，获得最佳EM 富硒酵母菌剂的制备工艺；同时探讨了EM 富硒酵母菌剂对水稻硒含量、产量和品质的影响，为EM 富硒酵母菌剂的后期开发应用奠定基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

水稻品种龙稻18 和EM 菌液（有效活菌数＞106cfu∕mL，主要成分为光合细菌、乳酸杆菌、芽孢杆菌、放线菌和丁酸梭菌等）由黑龙江省农业科学院水稻研究所提供；酵母（Saccharomyces cerevisiae）由东北农业大学寒地药用植物资源平台提供；1 000 mg∕L硒标准液和亚硒酸钠均购自哈尔滨市泰思阁生物科技有限公司；津国有机硒素（有机硒质量浓度＞6 g∕L）由唐山津国农业技术开发有限公司研制。

1.2 试验设计

1.2.1 EM 富硒酵母菌剂制备工艺条件的单因素试验 取亚硒酸钠、红糖30 g、酵母、3 L EM 菌液加入玻璃发酵罐中，充分混匀，调节pH 值后恒温发酵培养，进行EM 富硒酵母菌剂制备的单因素试验。预设酵母接种量8%、无机硒质量浓度5 g∕L、pH值4.0、发酵温度30 ℃、发酵时间3 d 为单因素试验中的常规值，分别研究不同酵母接种量（4%、6%、8%、10%、12%）、无机硒质量浓度（1、3、5、7、9 g∕L）、pH 值（3.0、3.5、4.0、4.5、5.0）、发酵温度（24、26、28、30、32 ℃）、发酵时间（1、2、3、4、5 d）对EM 富硒酵母菌剂有机硒质量浓度的影响，确定最优发酵条件。

1.2.2 EM 富硒酵母菌剂制备工艺条件的响应面试验 依据单因素试验结果选取影响因素及水平，见表1。根据Box-Behnken 中心组合原理设计试验。试验组合总数N=2k+2k+n0，式中，k表示独立变量个数，n0表示中心点在试验中的重复次数。分析各因素对响应值的影响，拟合回归曲线，预测最优发酵工艺条件[20]。按最优工艺条件进行3 次重复试验，对最佳发酵工艺条件进行验证。

表1 EM富硒酵母菌剂制备工艺条件的响应面试验设计Tab.1 Response surface test design for the preparation process conditions of EM selenium-enriched yeast agent

1.2.3 EM 富硒酵母菌剂在水稻上应用的大田试验 在黑龙江省肇东市（125°22′～126°22′E、45°10′～46°20′N）进行分区对比试验，样地土壤养分含量见表2。水稻灌浆初期，设置3 个喷施处理，分别喷施清水（CK）、EM富硒酵母菌剂和津国有机硒素，每个处理500 m2，3 次重复，每500 m2使用0.187 L，稀释30 倍，每7 d 喷施一次，连续喷施3 次。2021 年4 月14 日育苗，5 月11 日插秧，种植密度14 cm×30 cm（即24万穴∕hm2），每穴3～5株。肥料分为基肥、蘖肥和穂肥，基肥：史丹利复合肥（N-P2O5-K2O：15-15-15）150 kg∕hm2；蘖肥：史丹利复合肥60 kg∕hm2；穂肥：史丹利复合肥60 kg∕hm2。田间管理一致。

表2 土壤养分含量Tab.2 Soil nutrient content

1.3 测定项目及方法

1.3.1 酵母菌剂有机硒质量浓度 采用紫外分光光度法绘制硒标准曲线[20]。采用梯度稀释法将1 000 mg∕L 硒标准液配制成0、0.5、1.0、1.5、2.0 mg∕L硒溶液。向各梯度硒溶液中加入2 mL EDTA-2Na溶液，混匀后调pH 值至1.5～2.0，30 ℃水浴22 min，加入10 mL 甲苯振荡萃取后，使用紫外分光光度计测333 nm 下甲苯层的吸光度A 并绘制标准曲线。采用紫外分光光度法测定EM 富硒酵母菌剂的总硒质量浓度和无机硒质量浓度[21]。其中，发酵液消化处理后直接测总硒质量浓度；发酵液在65 ℃、40 kHz 下超声1 h 后过滤，测定滤液中硒质量浓度即为无机硒质量浓度。由总硒质量浓度和无机硒质量浓度计算有机硒质量浓度，公式如下。

式中：X表示硒质量浓度；C表示标准曲线对应硒质量浓度；m表示样品体积；V为测定时吸取消解液的体积；N1为样品测定时的稀释倍数；N2为样品消化时的稀释倍数。

1.3.2 茎和叶硒含量 在水稻乳熟期、蜡熟期，取各小区水稻的叶和茎，采用紫外分光光度法测定有机硒含量[21]。

1.3.3 产量及其构成因素 成熟期，随机选取3 点取样，每点取1 m2内相连的28株水稻植株进行有效穗数、空瘪率和千粒质量等指标测定[22]。

1.3.4 品质指标 籽粒硒含量采用氢化物原子荧光光谱法（GB 5009.93—2017）测定[23]，直链淀粉含量采用分光光度法（NY∕T 2639—2014）测定[24]，粗蛋白含量采用分光光度法（GB 5009.5—2016）测定[25]。

1.4 数据统计分析

采用Design-Expert 8.0.6 软件进行响应面设计分析，采用Excel 2019、GraphPad Prism 8.0.1 软件进行数据处理、绘图及显著性分析。

2 结果与分析

2.1 EM富硒酵母菌剂制备工艺条件的单因素试验结果

2.1.1 酵母接种量 由图1A 可知，发酵液中有机硒质量浓度随酵母接种量的增加呈现出先升后降的趋势。当酵母接种量达到10%时，发酵液中有机硒质量浓度最高；之后随着酵母接种量增加，发酵液中有机硒质量浓度减少。因此，酵母接种量以10%最佳。

图1 不同发酵条件对EM富硒酵母菌剂中有机硒质量浓度的影响Fig.1 Effect of different fermentation conditions on the concentration of organic selenium in EM selenium-enriched yeast agent

2.1.2 无机硒质量浓度 由图1B可知，有机硒质量浓度随无机硒质量浓度的增加呈现先增后降的趋势，在5 g∕L 下，底物与酵母中半胱氨酸合酶的结合达到饱和，发酵液中有机硒质量浓度最高。因此，无机硒质量浓度以5 g∕L最佳。

2.1.3 pH 值 pH 值可影响微生物生长代谢和酶解效率。由图1C 可知，当pH 值在3.0～5.0 时，发酵液中有机硒质量浓度随pH值变化较小，以pH值为4.0时最高。因此，pH值以4.0最佳。

2.1.4 发酵温度 温度是影响发酵反应和酶促反应的重要因素之一。由图1D 可知，发酵液中有机硒质量浓度随发酵温度的升高呈现出先升后降的趋势，当温度升高至30 ℃时，发酵液中有机硒质量浓度最高；随温度继续升高，酶活性受到抑制，导致发酵液有机硒质量浓度下降。因此，发酵温度以30 ℃为宜。

2.1.5 发酵时间 适宜的发酵时间可保证有机硒的充分转化。由图1E 可知，随发酵时间的增加，发酵液中有机硒质量浓度呈现先升高后趋于稳定的趋势，在3 d 时达到最高，之后发酵液中有机硒质量浓度基本不变。因此，发酵时间以3 d为宜。

2.2 EM富硒酵母菌剂制备工艺条件的响应面试验结果

2.2.1 响应面试验设计及结果 综合2.1 中单因素试验结果，选取对有机硒质量浓度影响较大的3 个因素酵母接种量（A）、无机硒质量浓度（B）和发酵温度（C）进行三因素三水平的响应面分析试验，试验结果见表3。将表3中数据进行多元回归拟合，得到表示有机硒质量浓度与各因素间关系的二次多项式回 归 方 程 ：Y=844.00-25.75A-2.00B+7.75C-14.75AB-2.25AC+42.75BC-89.63A2-82.12B2-62.63C2。

表3 EM富硒酵母菌剂制备工艺条件的响应面试验结果Tab.3 Response surface test results of EM selenium-enriched yeast agent preparation process conditions

对回归方程进行方差分析，结果见表4。该模型的P值为0.000 7（P＜0.01），即噪音影响仅0.07%的可能性，说明该模型极显著。在该模型中，A、BC、A2、B2和C2的P值均小于0.05，说明A、BC、A2、B2和C2是重要的模型项。失拟项P值0.147 0（P＞0.05），说明拟合的回归曲线与实际情况相符合，该模型可用于发酵工艺的分析和预测。各因素对响应值的影响显著性可用检验值F评价，F（A）=7.57，F（B）=0.05，F（C）=0.69，即各因素对有机硒质量浓度的影响表现为酵母接种量＞发酵温度＞无机硒质量浓度。由各因素P值可以发现，酵母接种量（A）对有机硒质量浓度的影响极显著（P＜0.01）；二次项A2、B2和C2的P值均小于0.01，对有机硒质量浓度的影响极显著；两两交互作用中，BC 对有机硒质量浓度的影响极显著（P＜0.01），说明无机硒质量浓度与发酵温度的交互作用对有机硒质量浓度的影响比较大。回归方程的误差统计分析中，R2=0.954 0，=0.894 8，显示该模型可反映89.48%的响应值变化；变异系数为3.61%，表明该模型能较好地反映真实试验值。综上表明，该模型对有机硒质量浓度具有较好的拟合度，可用于EM 富硒酵母菌剂制备工艺优化。

表4 回归模型方差分析结果Tab.4 Results of regression model ANOVA

2.2.2 响应面分析 响应面图形是对响应值对应试验因素的回归方程的形象描述，响应曲面的坡度反映该因素对响应值的影响。等高线图是三维曲面图的投影，等高线的椭圆化程度反映两两因素间交互作用大小。等高线的密集程度反映该因素对响应值的影响程度。由图2 可知，BC 交互作用的曲面弯曲程度最大，等高线图呈椭圆形，说明BC 交互作用对有机硒质量浓度的影响最大，AB次之。

图2 酵母接种量、无机硒质量浓度和发酵温度两两交互作用对EM富硒酵母菌剂中有机硒质量浓度的影响Fig.2 Effect of interactions of yeast inoculation，inorganic selenium concentration and fermentation temperature on the concentration of organic selenium in EM selenium-enriched yeast agent

如图2A 所示，等高线椭圆形说明AB 间有交互作用，相较于无机硒质量浓度，酵母接种量对有机硒质量浓度影响作用更强。在无机硒质量浓度一定时，有机硒质量浓度随酵母接种量升高呈现先升高后降低的趋势，在酵母接种量10%、无机硒质量浓度5 g∕L时达到顶点。

如图2B 所示，等高线近椭圆形说明AC 间交互作用不明显，相较于发酵温度，酵母接种量对有机硒质量浓度影响更大。在发酵温度一定时，有机硒质量浓度随酵母接种量的升高呈现先升高后降低的趋势，在酵母接种量10%、发酵温度30 ℃时达到顶点。

如图2C 所示，等高线椭圆形说明BC 间交互作用明显，相较无机硒质量浓度，发酵温度对有机硒质量浓度的影响更大。在无机硒质量浓度一定时，有机硒质量浓度随发酵温度的升高呈现先升高后降低的趋势，在无机硒质量浓度5 g∕L、发酵温度30 ℃时达到顶点。

2.2.3 响应面法优化结果及验证试验结果由回归模型得出，EM 富硒酵母菌剂制备的最佳条件：在3 L EM 菌液中，酵母接种量10%、无机硒质量浓度5 g∕L、发酵温度30 ℃，预测有机硒质量浓度为846.14 mg∕L。对上述条件进行3 次重复试验，得到EM 富硒酵母菌剂的平均有机硒质量浓度为833.61 mg∕L。0.20%的RSD和1.50%的相对误差表明该优化模型具备较好的稳定性。

2.3 EM富硒酵母菌剂在水稻富硒生产中的应用

2.3.1 茎、叶硒含量 水稻叶中有机硒含量可反映硒的吸收情况。由图3A 可以看出，对于水稻叶片，乳熟期，EM 富硒酵母菌剂处理有机硒含量较CK 和津国有机硒素处理显著提高，分别提高72.68%和84.36%；蜡熟期，EM 富硒酵母菌剂处理有机硒含量与CK 和津国有机硒素处理无显著差异，且三者均低于乳熟期。由图3B 可以看出，对于水稻茎，乳熟期，EM 富硒酵母菌剂处理有机硒含量较CK 和津国有机硒素处理显著降低，以津国有机硒素处理最高；蜡熟期，EM 富硒酵母菌剂处理有机硒含量与CK 无显著差异，两者均显著低于津国有机硒素处理，且除EM 富硒酵母菌剂处理外均低于乳熟期。综上，水稻叶对EM 富硒酵母菌剂的吸收主要在乳熟期。

图3 EM富硒酵母菌剂对水稻叶（A）、茎（B）有机硒含量的影响Fig.3 Effect of EM selenium-enriched yeast agent on organic selenium content of rice leaves（A）and stems（B）

2.3.2 产量及其构成因素 由表5可知，与CK和津国有机硒素处理相比，EM 富硒酵母菌剂处理水稻空瘪率显著降低，分别降低24.84%和21.23%；有效穗数分别提高6.39%和17.03%，但差异不显著；千粒质量差异不显著；产量为7 114.95 kg∕hm2，分别提高8.38%和7.52%，但差异不显著。说明喷施EM 富硒酵母菌剂对水稻有一定的增产作用，但不显著。

表5 EM富硒酵母菌剂对水稻产量及其构成因素的影响Tab.5 Effect of EM selenium-enriched yeast agent on rice yield and its components

2.3.3 品质 直链淀粉含量与稻米硬度、咀嚼性和弹性呈极显著正相关，而与黏度呈极显著负相关，是水稻口感的主要影响因素[26]。蛋白质是稻米的主要营养成分，其含量决定了稻米的营养品质。由表6可知，EM 富硒酵母菌剂处理籽粒直链淀粉含量最高，分别较CK 和津国有机硒素处理提高20.60%和30.86%，但3 个处理间差异不显著；3 个处理间粗蛋白含量差异也不显著；EM 富硒酵母菌剂处理硒含量最高，为0.24 mg∕kg，较CK显著提高23倍，且高于津国有机硒素处理。根据GB∕T 22499—2008《富硒稻谷》规定，富硒稻谷的硒元素含量为0.04～0.30 mg∕kg[27]，低于这个范围属于低硒稻谷，高于这个范围的稻谷具有毒性，不宜食用。可见，EM 富硒酵母菌剂处理稻米中硒含量达到富硒稻谷要求。

表6 EM富硒酵母菌剂对水稻籽粒直链淀粉、粗蛋白和硒含量的影响Tab.6 Effect of EM selenium-enriched yeast agent on the contents of amylose，crude protein and selenium in rice grain

3 结论与讨论

本研究以EM 菌液作为发酵液、无机硒为底物探究各发酵条件对有机硒转化的影响，主要考察酵母接种量、无机硒质量浓度、发酵温度、发酵时间和pH 值对有机硒质量浓度的影响。在单因素试验基础上，通过响应面法优化得到最佳发酵条件：在3 L EM菌液中，酵母接种量10%、无机硒质量浓度5 g∕L、发酵温度30 ℃、pH值4.0、发酵时间3 d；影响有机硒转化的因素表现为酵母接种量＞发酵温度＞无机硒质量浓度；该条件下有机硒质量浓度达833.61 mg∕L，而且具备较好的稳定性。发酵温度增加使有机硒质量浓度先增后减，可能是因为温度过高抑制微生物代谢和酶活性所致[28]。随着酵母接种量变化，有机硒质量浓度变化较大，这可能与酵母-EM 菌群的相互作用有关，酵母接种量影响EM 菌群中微生物的生长速度和发酵产物的组成，接种量10%时发酵罐中底物、营养与酵母量配比适宜，半胱氨酸合酶含量高，转化速率高[29-30]。pH 值对有机硒质量浓度影响微弱，可能是因为EM 菌群通过自身代谢物调节环境pH 值，使发酵罐内pH 值稳定在适宜的范围内[31]。

硒的吸收与转运是决定稻米中硒含量的关键，CAREY 等[32]研究发现，硒可能通过直接从茎向籽粒、剑叶向籽粒2 种途径进行转运，但EM 富硒酵母菌剂处理水稻在乳熟期和蜡熟期茎中硒含量低于CK，可能是乳熟期之前已完成转运。相较于水稻对亚硒酸盐吸收转运中的硒滞留情况[33]，EM富硒酵母菌剂基本没有。

张昊楠[34]研究发现，硒元素可以促进水稻根系生长和种子萌发。马洁等[35]研究发现，叶面施硒对水稻千粒质量、穗粒数无显著影响。本研究发现，施用EM 富硒酵母菌剂可显著降低水稻空瘪率，提高有效穗数和产量，但差异也不显著。HOEWYK[36]研究发现，水稻中硒代半胱氨酸可非特异性地参与蛋白质的合成，因半胱氨酸残基是大部分蛋白酶的活性中心位置，硒代半胱氨酸积累量可影响蛋白酶的折叠和催化功能，进而影响蛋白质的合成。但本研究中粗蛋白含量变化不显著。EM 富硒酵母菌剂可应用于寒地水稻的富硒生产，可使糙米中硒含量达0.24 mg∕kg，符合GB∕T 22499—2008《富硒稻谷》[27]规定标准。