灯盏花素在脑缺血疾病治疗中作用机制的研究进展

王 瑞,朴 龙

(延边大学 附属医院1.急诊科;2.康复科,吉林 延吉 133000)

急性脑梗塞是突然发生的脑组织缺血坏死或软化,中老年为好发人群,是糖尿病、肥胖症、高血压为常见诱因的一种神经系统疾病,其特征是脑部的血流供应障碍或受限,并常导致脑部缺血缺氧性病变及损伤[1]。脑梗塞的预后与急性期的有效治疗密切相关。灯盏花素具备使血液循环活化、改善血供的功效,它是传统药用植物灯盏花中国植物志正名为短庭葶飞蓬的粗略提取物。灯盏花素主要成分黄苓素(又名灯盏花乙素、野黄苓苷)具有很高的药用价值且安全性高[2]。目前灯盏花素已被用于脑血管疾病的治疗。

1 抗氧化应激机制

脑缺血损伤的重要病理机制是氧化应激反应,缺血缺氧后,活性氧(Reactive oxygen species,ROS)会过度产生,这可能跟氧化应激发生相关[3]。研究表明,通过激活NF-E2相关因子/血红素加氧酶-1(NF-E2-related Factor 2,Nrf2 / Heme oxygenase-1,HO-1)通路,可缓解缺血造成的细胞损伤。未发生脑缺血时,Kelch样ECH相关蛋白-1(Kelch-like ECH-associated protein-1,Keap1)途径可降解Nrf2;氧化物质产生时,打乱了Keap1-Nrf2结合,Nrf2与抗氧化应答元件(Antioxidant response elements,ARE)抗氧化反应通路被激活,使组织内的超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathion peroxidase,GSH-Px)和HO-1含量增高。同时增加Nrf2和HO-1可缓解缺血造成的组织氧化反应损害。Nrf2是调节机体发挥抗氧化作用的重要因子,它可以在转录水平上介导调节ARE的II期解毒酶,并发挥抗氧化作用的HO-1;在休息条件下,此酶在低水平下随处可见,并受到大量应激刺激的高度调节。实验表明,HO-1在宿主防御ROS生成和氧化损伤方面也起着不可替代的作用[4]。在缺血后的24 h,灯盏花素治疗显著增加了缺血区Nrf2和HO-1的表达,提示灯盏花素的保护作用可能与Nrf2和HO-1的上调节表达有关。

缺血再灌注后,减少氧自由基的蓄积是缓解微循环功能障碍的重要机制,细胞是ROS主要攻击对象,破坏它们的膜、线粒体等,还会导致细胞自身物质溶解造成机体内皮细胞的破坏。SOD具有抗氧化应激的能力,缓解细胞氧化损害。丙二醛(Malonaldehyde,MDA)是脂类物质氧化应激时的产物,可作为判断细胞和组织氧化损伤程度的的指标。王娓娓等[5]实验观察到灯盏花素抗氧化损伤效果,与缺血损伤组比较,SOD表达水平在受损的血管内皮细胞增加。一氧化氮(NO)是一种对神经细胞有毒的强力氧化应激产物,细胞缺血缺氧后,NO表达量明显提高。有实验表明:与缺血损伤组的大鼠相比,灯盏素治疗组、灯盏花素联合丙泊酚组使Nrf2和HO-1mRNA途径受到抑制,减少了大鼠海马组织MDA、NO表达含量,提高了SOD水平,改善了大鼠脑缺血损伤造成的神经功能障碍。GSH-Px能够清除氧化损伤时出现的MDA。缺血损伤组与灯盏花素组相比,发挥抑制氧化反应的SOD和GSH-Px表达显著提高,MDA含量显著减少,提高了细胞的存活率。NO的合成过程需要一氧化氮合酶(Nitric oxide synthetase,NOS)重要参与,发挥神经毒性作用的是诱导型NOS(iNOS)。楚丽丽等[6]通过实验观察到经灯盏花滴丸处理组与氧化应激损伤组比较发现,MDA含量显著减少,SOD活性提高,且iNOS活性及NO含量降低。综上所述,提示灯盏花素可通过抑制MDA、iNOS、NO表达,减少损伤细胞的氧化反应,提高SOD和GSH-Px含量,增加抗氧化能力从而发挥保护作用。

2 减轻细胞的炎性损伤

脑缺血损伤后,小胶质细胞被活化,致多种炎性介质的释放。炎性损伤是脑缺血损伤后一个复杂的过程。一旦过多产生促炎因子或者细胞毒性因子,如白细胞介素-1β(Interleukin-1 beta,IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor alpha,TNF-α)、NO等可导致神经细胞损伤[7]。因此,保证小胶质细胞不被过度激活,可减轻脑组织缺血后的炎性损伤。研究发现,灯盏花素在动物模型中可减轻炎性反应的作用,它可以抑制大鼠原代小胶质细胞系被脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)诱导的促炎介质如TNF-α、IL-1β、NO和ROS的产生。通过分别进行体内外的实验研究表明,灯盏花乙素使脑缺血大鼠和LPS诱导的BV-2小胶质细胞中促炎介质(TNF-α,IL-1β,NO和ROS)的产生减少,实验诱导产生的iNOS表达减少。提示灯盏花素通过抑制小胶质细胞活化,以此来减少神经细胞的炎性损伤。

反映全身炎性反应的标记物超敏C反应反蛋白(High-sensitivity C-reactive anti-protein,hs-CRP),可作为监测心脑血管疾病的有效指标之一。研究发现,hs-CRP的降低,可以改善机体的炎性损伤,减轻神经功能障碍[8]。有研究观察到联合应用灯盏花素组的患者与常规用西药的患者相比,不仅降低了hs-CRP,还减少了炎症指标TNF-α水平,可用于评估脑缺血的预后情况。机体发生炎性反应时,NF-κB起到关键性作用,研究发现,当细胞发生增值凋亡、炎性损伤时,NF-kB-p65蛋白和其抑制性蛋白IkB-α可发挥重要的作用。丁丹等[9]研究表明缺血损伤后的大鼠降低了p65蛋白,使IκB-α蛋白表达提高,灯盏花素在缺血大鼠模型中发挥抑制炎症损伤的作用。在各种先天性免疫细胞中发现了Toll样受体(Toll-like receptor,TLR),在大脑中,TLRs的表达主要由胶质细胞中的小胶质细胞和星形胶质细胞完成,与相应配子附着时,可以产生促炎因子。在脑缺血条件下,神经元中TLR2,TLR4和TLR9的表达升高,大量研究证明,脑缺血导致的炎性反应时,TLR2和TLR4可与内源性配体结合并发挥重要作用[10]。研究显示,IL-6和TNF-α受TLR4/NF-κB信号通路调节。童军卫等[11]实验结果显示,灯盏花素组与模型组比较大脑皮质中NF-κB和TLR4表达减少,提示灯盏花素在脑缺血损伤时可通过抑制TLR4/NF-κB 通路的上调减轻脑细胞的炎性损伤。

3 减弱血脑屏障破坏

维持血脑屏障(Blood brain barrier,BBB)结构完整性对保护神经中枢系统稳态具有重要意义。小胶质细胞和星形胶质细胞在脑组织血液循环供应不足时被激活,炎症因子发生聚集,BBB通透性增加大量有害物质进入,使其结构受到破坏,将会导致大脑炎症反应和脑水肿的发生[12]。有实验结果指出,单用灯盏花素和联合应用灯盏花素和冰片组与模型组大鼠比较,脑缺血后能明显提高跨内皮细胞电阻(Transendothelial electrical resistance,TEER)值并使辣根过氧化物酶(Horse radish peroxidase,HRP)的通透率回降,保护BBB完整性;在蛋白表达水平上,联合组与灯盏花素均使内皮细胞的紧密连接蛋白-1(Zonula occluden 1,ZO-1)和大脑紧密连接蛋白-5(Claudin-5)蛋白的表达增加。以上研究提示灯盏花素改善BBB缺血损伤的机制可能与增加ZO-1和Claudin-5蛋白的表达有关。基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinases,MMPs)中十分重要的两种酶基质金属蛋白酶2和9(MMP-2、MMP-9)能够将紧密连接的蛋白(TJ)降解破坏BBB结构完整性[13]。与反应性星型胶质细胞、血管内皮细胞、组织细胞相关的是MMP-2,与细胞炎症反应相关的是MMP-9[14]。实验研究表明,治疗组与模型组大鼠比较,缺血损伤后,BBB的通透性增加,伊文思蓝(Evans blue,EB)含量随着MMP-2和MMP-9表达变化,说明MMP-2和MMP-9和血脑屏障存在密切的相关性。用灯盏花素治疗后,模型组大鼠脑部的MMP-2和MMP-9表达降低,脑组织中的EB含量也降低。提示灯盏花素减轻脑细胞损伤的机制可能与抑制MMP-2和MMP-9表达,减轻血脑屏障破坏有关。

4 减少神经细胞凋亡

脑循环缺血时,神经细胞为了维持机体内环境自主性的有序死亡,即神经细胞的凋亡。脑血管狭窄或闭塞时,神经细胞的过度或不当凋亡会引起神经功能障碍。因此,神经细胞的保护,成为脑缺血治疗的关键。细胞凋亡依赖于半胱天冬酶-3(Caspase-3),Caspase-3可被多种途径激活,一旦被激活可以诱发神经细胞的不可逆性凋亡[15]。王少华等[16]实验发现治疗组大鼠与模型组相比,TUNEL染色显示棕色和褐色凋亡细胞的数量和海马组织中Caspase-3蛋白表达下降,抑制了触发细胞凋亡的途径。脑缺血时线粒体受损,细胞凋亡被启动。Lu Yang等[17]实验表明模型组TUNEL阳性细胞增多,给药组减少。一些凋亡相关的位点与灯盏花的活性成分具备结合能力,缺血部位的(BCL2-Associated X,Bax)、细胞-c和Caspase-3的表达受限。表明灯盏花的活性成分对脑缺血损伤的细胞凋亡起到重要的抑制作用。提示灯盏花素能通过减少Bax、Caspase-3的表达抑制神经细胞凋亡,增加细胞活力。在脑缺血损伤中,介导炎性反应和促进神经细胞凋亡的主要是由p38和JNK参与的,而ERK发挥保护神经细胞免受损害的作用[18]。NO含量可诱导神经细胞凋亡发生,随着其含量的增加,加剧神经元产生的毒性作用,增加细胞凋亡数量。有研究指出,灯盏花素治疗后激活小胶质细胞的p38和JNK表达被显著下调,p-ERK被上调,同时还降低了iNOS、TNF-α、IL-1β等炎性介质。提示灯盏花素可通过抑制p38和JNK,上调p-ERK,减少NO含量,抑制TNF-α、IL-1β等炎性因子表达,减少细胞凋亡数量,降低脑细胞炎性损伤,缓解神经功能损伤。

5 促进新生血管生成

研究发现:内皮细胞在缺血灌注损伤后,更早出现受损,引发一系列炎性反应、血栓形成等效应,加速细胞的凋亡和死亡发展[19]。血管内皮细胞(Vascular endothelial cell,VECs)的损伤会导致各种内皮细胞的功能障碍,促炎因子的释放和氧自由基的生成[20]。缺血缺氧条件下,上游缺氧诱导因子(Hypoxia-inducible factor,HIFs)可被触发,从而激活下游血管生成中最有效的血管生成因子——血管内皮生长因(Vascular endothelial growth factor,VEGFs)等一系列因子的表达,启动生成新血管的过程,使细胞对损伤做出反应[21]。VEGF在缺血性疾病损伤修复中起着重要作用,形成新的血管过程是通过增加微循环中的血管通透性,内皮细胞的增殖及迁移启动的。王震雨等[22]研究指出,用药组与模型组大鼠脑组织VEGF蛋白表达比较明显增高,说明灯盏花素减轻脑细胞损伤作用与促进新生血管形成有关。血小板内皮黏附因子-1(Platelet endothelial adhesion factor-1,PECAM-1)存在于各种细胞,包括内皮细胞、T细胞、中性粒细胞、单核细胞等甚至某些亚基也会表达[23]。有研究发现,PECAM-1可参与体内外的新生血管形成[24],通过一些实验观察到,PECAM-1表达缺陷的小鼠细胞在体外不能形成管样结构;而过度表达PECAM-1可以形成管样结构。由此可见,PECAM-1是形成血管的重要标志物。内皮下基底膜和细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)的降解是血管形成的最基本步骤[25]。因此,能激活降解ECM酶是血管生成的基础。MMPs可以分解EMC,同时可促进内皮细胞迁移。实验结果显示,应用灯盏花素后在免疫印迹和RT-PCR技术检测到PECAM-1的蛋白和mRNA的含量增加明显;药物处理后的内皮细胞中MMP-2的mRNA活性增加。以上研究表明,灯盏花素可能通过上调VEGF和PECAM-1表达及增加MMP2活性,改善脑缺血引发的血管内皮功能障碍。

6 小结

灯盏花素在脑缺血防治中,已获得一定的研究进展。文中提到,灯盏花素在不同方面发挥脑保护作用,它降低MDA含量,提高SOD和GSH-Px表达,以此降低氧化损伤程度。灯盏花素通过TLR4/NF-κB信号通路调节IL-6和TNF-α等炎症因子;可通过增加ZO-1和Claudin-5,抑制MMP2和MMP9减轻对BBB破坏;通过抑制Bax、Caspase-3表达,下调p38和JNK且上调p-ERK,减少细胞凋亡;还可通过增加VEGF和PECAM-1,改善血管内皮损伤。但脑损伤机制十分复杂,其保护信号通路及各因子之间关系尚未完全被阐明,需要进一步应用各种模型和技术深入研究。