滇产5种经济竹种竹叶黄酮含量比较及体外抗氧化活性研究*

李翱翔，张加研，赵一鹤

(1.西南林业大学 材料与化学工程学院，云南 昆明 650224；2.云南省林业和草原科学院，云南 昆明 650201)

云南拥有丰富的竹资源，包括28个属，280余种[1]，其中牡竹属(DendrocalamusNees)、方竹属(ChimonobambusaMakino)、香竹属(ChimonocalamusHsueh et Yi)等竹类植物具有重要的经济价值，以牡竹属竹种最具云南热带竹子的特色。相比于竹子的其他部分利用，竹叶几乎被视为废弃物，每年有超过80%的竹叶都会腐烂在竹林中。为了实现竹叶的高价值利用，近20年来科技人员对提取竹叶黄酮等有价值的活性成分越来越感兴趣，并将其应用于新产品的开发，以拓展竹资源产业链[2-3]。本研究从以上3个竹属中选取具有代表性的4种竹种进行研究，分别是勃氏甜龙竹(Dendrocalamusbrandisii)、龙竹(D.giganteus)、大叶慈竹(D.farinosus)、刺竹子(Chimonobambusapachystachys)和流苏香竹(Chimonocalamusfimbriatus)。

竹叶提取物中含有黄酮类化合物、多糖、矿物质以及其他多种成分，并且已经被用于治疗多种疾病[4]。竹叶中的黄酮类化合物包括黄酮类、内酯类和酚酸类化合物。其中黄酮类化合物以黄酮C苷为主要活性物质[5]。研究表明，竹叶黄酮具有抗氧化、清除亚硝化物、阻断亚硝化反应、消除溃疡和抑制肿瘤活性，以及降低动脉粥样硬化、老年痴呆症、帕金森综合征和高血脂高血糖的风险[6-8]。竹叶中提取的黄酮类化合物在食品、饮料、药品、化妆品等方面有广泛的应用。

人体内会产生大量的自由基，组织内的能量传递以及体内毒素的排出都需要适量的自由基参与，但是当产生过多的自由基且无法被身体清除掉时，过量的自由基将对人体造成细胞衰老、诱发细胞癌变、引起动脉粥样硬化、引起炎症反应等严重伤害[9]。根据各种研究报道，竹叶黄酮具有良好的抗氧化活性[10-12]，目前尚缺乏关于滇产不同竹种竹叶黄酮含量的比较分析，尤其是不同竹种竹叶提取物的体外抗氧化活性能力的研究报道。因此，本研究以滇产5种经济竹种竹叶为试验材料，分析不同竹种竹叶黄酮的总含量和主要黄酮碳苷的种类及含量，重点在于比较不同竹叶提取物的体外抗氧化效果，筛选出抗氧化能力较强的竹种竹叶提取物，为进一步开发抗氧化和抗衰老的产品提供理论和科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

(1)实验材料 勃氏甜龙竹和龙竹竹叶于2022年10月采摘自云南省普洱市景谷县(23.497 0°N、100.702 8°E，海拔1 866 m)，大叶慈竹、箣竹子及流苏香竹的竹叶均采自云南省林业和草原科学院昆明树木园(25.0845°N、102.4442°E，海拔1 891 m)。采摘期连续降雨，采摘区域立地条件温度适宜，水分充足，采光较好，选择母竹秆龄在两年以上竹子树冠部分的新鲜竹叶，去除叶柄和叶鞘部分，清洗，去除竹叶表面虫卵等杂质，叶表霉菌以及真菌清除干净；置于干燥通风处风干至含水量低于12.0%，将其粉碎后过60目筛网，用PE保鲜袋分别装好，放入干燥皿中备用。

(2)试剂 芦丁(≥98.0%)、荭草苷(≥98.0%)、异荭草苷(≥98.0%)、牡荆苷(≥98.0%)、异牡荆苷(≥98.0%)标准品购自诗丹德标准技术服务有限公司(中国上海)，氢氧化钠、乙醇、乙酸、磷酸、甲醇、乙腈、氯仿、亚硝酸钠、硝酸铝和聚酯酰胺树脂(60～80目)(均为分析纯，其中磷酸、甲醇和乙腈为色谱纯)购自致远化学试剂有限公司(中国天津)。DPPH自由基清除率、羟基自由基清除率以及超氧阴离子清除率检测试剂盒由Solarbio科技有限公司(中国北京)生产。

1.2 仪器与设备

Cary 5000双光束紫外可见分光光度计：Agilent Technologies；Ultimate 3000高效液相色谱仪：Thermo；RE-2000A旋转蒸发器、SHB-III循环水真空泵、DL-2005低温冷却液循环泵：上海谷宁仪器有限公司；101-3AB电热鼓风干燥箱、DK-98-IIA电热控温水浴锅：天津市泰斯特仪器有限公司；PX224ZH电子天平：奥豪斯仪器(常州)有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 竹叶黄酮的提取工艺

称取1.0 g处理保存的竹叶干粉，置于平底烧瓶后加入70%的乙醇溶液50 mL，进行水浴加热回流提取，温度80 ℃，时间120 min。竹叶黄酮粗提液冷却至室温后，进行减压抽滤除去滤渣，用少量的提取溶剂洗涤滤渣，合并滤液并置于圆底烧瓶中。50 ℃下减压浓缩，除去滤液中的乙醇。倒出烧瓶内剩余溶液，并用适量50 ℃的超纯水分三次洗涤烧瓶，将洗涤烧瓶的液体与目标溶液合并，进行二次抽滤后置于分液漏斗中，每次25 mL的三氯甲烷进行3次萃取脱脂，萃取脱脂后，收集下层的水溶液置于50 mL的容量瓶中并用超纯水定容至刻度线。脱脂后的粗体液进行柱层析法纯化，将处理好的聚酰胺树脂进行湿法装柱。待测液与聚酰胺树脂的比例应在1︰2(mL︰g)左右，吸取上述适量脱脂后的粗体液加入层析柱内，等待溶液充分吸附后，选取70%乙醇作为洗脱液进行洗脱，洗脱液的流速控制在1.0 mL/min，等到流出液基本无色后收集10 mL，用70%乙醇定容后即可用于测定。

1.3.2 竹叶黄酮总含量测定

(1)芦丁标准曲线的制作

芦丁标准品精确称量15.0 mg后，用适量甲醇进行超声溶解，并转移至100 mL的容量瓶中定容至刻度线，制成芦丁标准储存液，恒温4 ℃下避光保存。取适量芦丁标准储存液进行梯度稀释，在6个10 mL的比色管中分别加入芦丁标准储存液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL，分别加入0.3 mL的5% Na2NO2溶液，充分摇匀后静置5 min左右，后加入0.3 mL的10% Al(NO3)3溶液，充分混匀，计时反应60 min，加入2 mL的1.0 mol/mL NaOH溶液进行显色反应，最后以30%乙醇定容至刻度，相同条件下不加芦丁标准储存液作为空白对照，于510 nm处测定吸光度，绘制芦丁的标准曲线；得出线性回归方程如下。

Abs=0.011 74C+0.000 39(R2=0.999 13)。标准曲线如图1。

图1 芦丁标准曲线

(2)竹叶黄酮总含量的计算

①

式中：X为样品总黄酮含量〔g/(100 g)〕，m1为依据标准曲线计算出被测液中黄酮含量(μg)，m为试样的质量(g)，V1为待测液分取的体积(mL)，V2为待测液的总体积(mL)。

1.3.3 竹叶中4种黄酮碳苷含量的测定

参考王晖[13]和陈再兴[14]的检测方法，适当调整后测定竹叶中4种黄酮碳苷的含量，色谱条件：色谱柱为AcclaimTM120 C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为2%冰乙酸∶乙腈(86∶14)；流速控制在1.0 mL/min，柱温箱温度设定为40 ℃。进样量为20 μL，检测波长350 nm。对照品溶液的制备精密称取荭草苷、异荭草苷、牡荆苷、异牡荆苷对照品适量，加甲醇超声溶解定容制成含量分别为0.186，0.085，0.191，0.205 mg/mL的储备溶液，将储备溶液经0.45μm微孔滤膜滤过，即为对照品溶液[15]。将供试品溶液将上述1.3.1提取浓缩后的不同竹叶提取液经0.45 μm滤膜滤过后即为供试品溶液，取供试品溶液20 μL进样测定。以超纯水作为空白。

标准曲线的绘制及线性范围考察[16]精密吸取荭草苷、异荭草苷、牡荆苷和异牡荆苷(分别为0.186，0.085，0.191，0.205 mg/mL)对照品进行梯度进样测定(2.0、4.0、8.0、12.0、16.0 μL)，线性回归纵坐标为峰面积的积分值，横坐标为标准品的进样量(μg)，结果见表1。

表1 回归方程与线性范围

1.4 竹叶黄酮抗氧化性评价

1.4.1 DPPH的清除作用

竹叶黄酮对DPPH的清除作用参考文献[17]测定方法改进如下，在2 mL的EP管中加入950 μL浓度为0.067 mg/mL的DPPH-甲醇溶液，然后分别加入50 μL由上述1.3.1提取工艺得到的不同竹种竹叶黄酮提取液样品，充分混匀，室温避光反应20 min，于1 mL石英比色皿测定515 nm吸光值(超纯水调零)，每个重复测定3次，另外相同条件下加入50 μL超纯水为空白组，以抗坏血酸(浓度为0.839 mg/mL)作为阳性对照，按式②计算清除率。

②

式中：A为DPPH清除率(%)，A0为空白组吸光度，A1为待测样品吸光度。

1.4.2 羟基自由基的清除能力

竹叶黄酮对羟基自由基的清除能力参考文献[18]测定方法改进如下，每个2 mL的EP管中依次加入150 μL浓度为0.5 mg/mL的1，10-菲罗啉(邻二氮菲)溶液、100 μl浓度为2.1 mg/mL FeSO4溶液、100 μL 6.6 mmol/L的H2O2溶液，然后分别加入250 μL由上述1.3.1提取工艺得到的不同竹种竹叶黄酮提取液样品，混匀，恒温水浴37 ℃下反应60 min，超纯水调零后，于1 mL石英比色皿测定536 nm吸光值，每个重复测定3次，另外相同条件下加入650 μL超纯水为对照组；不加过氧化氢溶液，直接加750 μL超纯水作为空白组；以抗坏血酸(浓度为0.839 mg/mL)作为阳性对照，按式③计算清除率。

③

1.4.3 超氧阴离子的清除能力

竹叶黄酮对超氧阴离子的清除能力参考文献[19]测定方法改进如下，每个5 mL的EP管中加入Tris-Hcl缓冲液24 μL(36.2 mg/mL，pH 9.2)，加入1.6 mL浓度为0.5 mg/mL的(NH4)2S2O8溶液，25 ℃反应1 min后，然后分别加入0.4 mL由上述1.3.1提取工艺得到的不同竹种竹叶黄酮提取液样品，加入0.8 mL浓度为0.7 mg/mL的盐酸羟胺溶液，充分混匀，恒温水浴37 ℃反应30 min，分别加入C6H7NO3S—CH3COOH缓冲液和α-萘胺-CH3COOH缓冲液(3.0 mg/mL pH 2.8；1.0 mg/mL pH 2.8)，充分摇晃均匀以后，在37 ℃恒温条件下进行显色反应20 min，另外相同条件下加入0.4 mL超纯水为对照组，不加过硫酸铵，直接加入2 mL超纯水作为空白管，以抗坏血酸(浓度为0.839 mg/mL)作为阳性对照，于1 mL石英比色皿，以空白管调零，在530 nm处测定对照管和测定管的吸光值。每个重复测定3次，按式④计算清除率。

④

1.5 数据分析

所有指标数据进行了3次重复实验测定。数据通过Microsoft Excel和IBM SPSS Statistics 27进行整理计算以及ANOVA方差分析(P<0.05为显著差异)，图像使用origin 2021进行绘制。

2 结果与分析

2.1 5个竹种的竹叶黄酮总含量的分析比较

对比5个不同竹种的竹叶黄酮含量如图2所示，由图2可知，竹叶黄酮的总含量变化规律为：流苏香竹>龙竹>勃氏甜龙竹>箣竹子>大叶慈竹。流苏香竹竹叶总黄酮的含量显著高于其他4个竹种(P<0.05)，龙竹次之，其他3个竹种之间黄酮总含量无显著性差异(P>0.05)。通过对比发现流苏香竹竹叶中含有的有效成分最多，这为研究竹叶黄酮生物活性提供了较佳的实验材料；同时也发掘出流苏香竹的科研价值。

2.2 不同竹种竹叶主要黄酮碳苷的种类及含量对比分析

通过对4种黄酮碳苷进行定性分析，得到它们各自的峰保留时间如图3，得出四种碳苷标准品的保留时间后，与样品相应的成分进行比对(图4)。其中异牡荆苷保留时间最长，异荭草苷保留时间最短。HPLC检测样品中所含四种碳苷黄酮的分类及含量见表2。

图3 4种黄酮碳苷标准品色谱

图4 供试品与四种碳苷标准品比对色谱

不同竹种龙竹、勃氏甜龙竹、箣竹子、大叶慈竹、流苏香竹竹叶中的4种碳苷含量总和变化规律分别为龙竹>勃氏甜龙竹>箣竹子>大叶慈竹>流苏香竹。

2.3 不同竹叶提取液体外抗氧化能力试验结果

2.3.1 DPPH清除能力分析

不同竹叶提取液对DPPH清除率测定如图5所示，不同竹种竹叶提取液对DPPH的清除率能力为流苏香竹>龙竹>箣竹子>大叶慈竹>勃氏甜龙竹，流苏香竹77.86%、勃氏甜龙竹仅为18.10%；流苏香竹和龙竹对DPPH清除率显著高于其他竹种(P<0.05)，流苏香竹的清除能力最好，略高于阳性对照Vc对DPPH的清除率，由此可以看出，流苏香竹竹叶提取液对DPPH有较强的清除能力。黄酮类化合物具有良好的抗氧化能力[20]，流苏香竹中含有多种黄酮类化合物，推测可能是多种黄酮类化合物的协同作用，提高流苏香竹竹叶提取物的抗氧化能力。

图5 样品DPPH清除率与Vc对照

2.3.2 羟基自由基清除能力分析

不同竹叶提取液对羟基自由基清除率测定如图6所示，不同竹种竹叶提取液对羟基自由基的清除率变化规律为流苏香竹>龙竹>箣竹子>大叶慈竹>勃氏甜龙竹，流苏香竹97.29%、勃氏甜龙竹仅为3.76%；其中流苏香竹对羟基自由基清除率显著高于其他竹种(P<0.05)，流苏香竹的清除能力最好，远高于阳性对照Vc对羟基自由基的清除率，由此可以看出来，流苏香竹竹叶提取液对羟基自由基有很强的清除能力。

图6 样品羟基自由基清除率和Vc对照

2.3.3 超氧阴离子清除能力分析

不同竹叶提取液对超氧阴离子的清除率测定如图7所示，变化规律为箣竹子>大叶慈竹>勃氏甜龙竹>流苏香竹>龙竹，不同竹种竹叶提取液对超氧阴离子的清除率分别为：箣竹子84.65%、龙竹59.05%；其中箣竹子对超氧阴离子清除率显著高于其他竹种(P<0.05)，综合对比不同竹种竹叶提取液对超氧阴离子清除的能力，即，箣竹子的清除能力最好，高于阳性对照Vc对超氧阴离子的清除率，不过这几种竹叶提取液对超氧阴离子都有较为良好的清除能力，除龙竹外，均在60%以上，由此可以看出来，流苏香竹竹叶提取液对超氧阴离子也有很好的清除能力。

图7 样品超氧阴离子清除率和Vc对照图

3 讨论与结论

本研究以滇产5种经济竹竹叶为实验材料，通过分光光度法[21]和高效液相色谱法[22]两种检测方法，对竹叶黄酮的总含量以及主要的黄酮碳苷进行分析对比，比较5种竹叶提取液的体外抗氧化活性研究，最后确定最优竹种的竹叶。通过不同的检测方法得出，流苏香竹的竹叶总黄酮含量最多，高达1.083 g/(100 g)，其中主要4种黄酮碳苷分析，龙竹竹叶中4种碳苷均含有，其中异荭草苷最多20.248 mg/g，龙竹竹叶中4种黄酮碳苷的总含量34.997 mg/g，异荭草苷含量与国家关于竹叶抗氧化物标准中规定值(≥2%)相比[23]，完全超过了最低标准值。流苏香竹的碳苷含量仅1.491 mg/g，但是其总黄酮的含量最多，根据液相色谱图中分析得出流苏香竹的提取液其他成分较多，可能是黄酮O苷的含量及其他类黄酮物质含量高于其他竹种。重点分析不同竹叶提取液对1,1-二苯基-2-苦基肼(DPPH)[24]、羟基自由基(·OH)[25]、超氧阴离子(O2·-)[26]的清除能力，流苏香竹竹叶提取液对DPPH、羟基自由基和超氧阴离子的清除率分别为：77.86%、97.29%和67.48%。得出流苏香竹的竹叶提取物是最为理想的，龙竹次之，对比竹叶黄酮的总含量以及体外抗氧化实验结果，得出最优竹种是流苏香竹。

魏琦等[27]对10个竹种竹叶中的13种黄酮类化合物进行了测定，其中包括牡竹属中的龙竹、勃氏甜龙竹和大叶慈竹，本文中龙竹、勃氏甜龙竹和大叶慈竹的叶黄酮总含量测定结果均高于这13种黄酮总量的测定结果，可能是由于分光光度法的局限性所致。以芦丁为标准品的显色法中，只要具有类似芦丁结构的黄酮化合物，比如酚酸类，内酯类物质，也可能会有显色反应。此外，在提取和脱色的过程中，脱色不完全可能会导致实验结果偏高。对于4种主要黄酮苷的测定结果接近，是因为采用了高效液相色谱法，并且由于色谱条件和处理方法的不同，导致了一些偏差。竹叶黄酮的抗氧化能力已经被许多研究文章所报道，比如段丽娜等[28]的研究表明龙竹竹叶黄酮具有良好的抗氧化能力；黄珊等[29]的研究结果显示方竹竹叶黄酮也具有较强的抗氧化活性。这些研究都证实了竹叶黄酮在抗氧化生理活性方面的重要性。本文中除了流苏香竹外，其他竹种的抗氧化性能与前人的研究相似，进一步验证了竹叶黄酮的科研价值。流苏香竹提取液显示出较高的抗氧化能力，表明其抗氧化的活性成分的种类和含量较多。目前尚缺乏关于流苏香竹竹叶具体化学成分的分析报道，这为后续的科研工作者提供了有价值的研究材料，可能会有新的化合物被发现。