不同来源菌根土对思茅松幼苗的接种效应研究*

卯吉华，杨斌，2，姜远标，2，李荣波，景跃波，2

(1.云南省林业和草原科学院，云南 昆明 650201；2.国家林业草原思茅松工程技术研究中心，云南 昆明 650201)

思茅松(Pinuskesiyavar.langbianensis)为松科(Pineaceae)松属(Pinus)植物，是卡西亚松(Pinuskesiya)的地理变种，在我国天然分布于云南南亚热带及准热带的湿润及半湿润地区，集中分布于思茅、景东、镇沅、景谷、普洱、墨江等县市[1-3]。其材质优良，具有速生、纤维长、松脂产量高等特点，是云南热区的优良乡土树种之一，在区域林业发展中占有重要的地位。

外生菌根(ectomycorrhizal，ECM)真菌是森林生态系统中土壤微生物的重要组分，很多研究已证实，ECM真菌对宿主植物的生长和发育起着关键作用，能增强植物对水分的吸收、提高植物的抗旱性[4-5]、增强植物对养分的吸收[6]、减少植物对外源肥料的需求和提高苗木的造林成活率[7]，同时保护植物免受病原菌的侵害[8]。

目前通过外生菌根真菌促进松科植物生长和提高其抗逆性已有广泛报道，如：徐玲洁等[9]研究表明，接种牛肝菌属(Suillus)真菌显著提升了油松(P.tabulaeformis)的地径、地上和地下部分生物量，分别提高了30.00%、31.57%和47.37%，并显著促进了苗木地上及地下部分N、P、K含量的提高。赵敏等[4]研究发现，分离自樟子松(P.sylvestrisvar.mongolica)林地的浅黄根须腹菌(Rhizopogonluteolus)、褐环粘盖牛肝菌(Suillusluteus)、粘盖牛肝菌(S.bovinus)、亚褐环粘盖牛肝菌(S.subluteus)、黄褐口蘑(Tricholomafulvum)接种樟子松幼苗形成了棒状、二叉状和羽状等不同形态的菌根，显著促进了苗木高生长和生物量的积累。外生菌根真菌接种对苗木生长和营养元素吸收利用的效应，在其他一些松属树种如马尾松、华山松、云南松和湿地松上也有相关的研究证实[10-13]。

思茅松是典型的外生菌根共生树种，对菌根真菌的依赖性很强，菌根土在思茅松育苗中的应用效果已被证实[14-15]，另外张春霞等[16]研究并报道了印度块菌(Tuberindicum)与思茅松苗木的菌根合成，研究发现印度块菌接种显著促进了思茅松苗木的生长。可见，利用外生菌根真菌资源培育思茅松菌根化苗木具有广阔的应用前景。

尽管在思茅松菌根方面开展了一些研究，然而还远远不够深入，发掘具有优良促生效果菌种的研究也十分缺乏，制约了菌根技术在该树种上的应用。有研究表明，自然生境的植物通常共生着丰富的真菌资源，生境中的土著菌种具有巨大的开发潜力[9]，天然菌根土即可用作接种剂[17-18]。本研究在云南省思茅松的主要栽培和分布区，选取中龄思茅松林的菌根土作为接种体，开展不同来源菌根土人工接种的盆栽试验，研究土著菌对思茅松苗木的共生情况和接种效果，为研发思茅松高效菌剂和构建优良菌种组合体系提供依据和材料。

1 材料与方法

1.1 试验材料

在云南思茅松的主要分布区，采集中龄思茅松林的根际土壤作为参试的菌根土，6个采样点采样林分分别是镇沅县勐大镇勐统村东边组人工林(ZY)、云南省林业和草原科学院普文试验林场人工林(PW)、普洱市思茅区万掌山林场人工林(WZS)、云景林业开发有限公司思茅松无性系种子园(JG)、威远江自然保护区思茅松天然林(WYJ)和墨江县新安镇挖岩村丁帕组人工林(MJ)。2021年3月，在每一个采样点，随机选取10株思茅松，采集根际土壤样品，先用锄头、铁锹和小铁铲等工具在主干附近挖掘，找出一级侧根，然后沿着侧根方向追溯到细根，从细根上抖落土壤以及从细根附近采集根际土，拣除杂质。土样采回后风干，过2 mm土样筛，得到的菌根土即用于接种试验。供试思茅松种子采自景谷林业示范区示范林场思茅松种子园。本试验共6个接种处理，1个不接种的对照，每一处理为24株参试苗木。

1.2 试验方法

1.2.1 幼苗的接种及培养

接种试验于2021年4月开始在云南省林业和草原科学院温室进行。选取颗粒饱满、大小均匀、无机械损伤的思茅松种子，先用0.5%的KMnO4溶液表面消毒30 min，后用无菌水冲洗数次后，然后用30 ℃温水浸种12 h，用草炭加蛭石体积比1︰1混合作基质，基质经过高温高压蒸汽灭菌处理(121 ℃，2 h)，接种试验时，先将基质装入高18 cm，直径12 cm的育苗袋，用玻棒戳一个深2～3 cm左右的孔穴，把准备好的思茅松菌根土放入孔穴(20 g/株)，搅拌使菌根土与育苗袋中上半部分的基质充分混合，试验同时设置对照(CK)处理，即将6个地点采集的菌根土等量混合，进行高温高压蒸汽灭菌(121 ℃，2 h)后，按20 g/株加入育苗容器中。将经过表面消毒和温水浸种处理的思茅松种子，播于育苗营养袋内，每袋点播2～3粒，后将种子覆盖，用喷雾器浇透水，置于温室中培养，待思茅松芽苗高度2～3 cm时，观察同一营养袋里出苗的情况，挑选留下一株生长最好的芽苗，其余的轻轻拔除，试验期间苗木按照常规管理，适时适量浇水，使基质保持湿润，不施用肥料和杀菌剂。

1.2.2 幼苗菌根形态观察和菌根侵染率的统计

接种8个月后，每一处理随机取6株幼苗进行根系形态观察和菌根侵染率的统计。菌根形态采用体视显微镜进行观察；采用划线交叉法测定思茅松幼苗根系的菌根侵染情况[19]。将根系清洗干净，剪成小段，在底部划分有方格的培养皿中分散均匀铺开，观察统计与方格线相交的点是否形成菌根，计算菌根侵染率。

1.2.3 苗木生长及叶绿素含量的测定

对所有参试思茅松幼苗测定苗高和地径，用直尺测量苗高，用游标卡尺测量地径。每一个处理随机抽取6株苗木测定生物量，将幼苗整株取出清洗干净，沿幼苗茎基部剪断，分开地上部分和地下部分，用烘箱在105 ℃杀青30 min后，在80 ℃下烘干至恒重，用天平称量干重。每一处理随机抽取6株参试苗木，采用分光光度计法测定针叶的叶绿素含量[20]。

1.3 数据处理及分析

所有数据均采用Excel进行统计，并绘制图表，用DPS 19.05软件进行方差分析和Ducan多重比较检验差异的显著性。

2 结果与分析

2.1 思茅松幼苗的菌根侵染率及菌根形态

经不同来源菌根土接种处理的思茅松苗木，根系均形成了典型的外生菌根结构，形态有棒状、二叉分支、密簇二叉分支等多种形状(图1)，而对照未形成菌根。不同来源菌根土对思茅松苗木根系的侵染能力存在差异，ZY、PW、WZS、JG、WYJ、MJ等各处理的侵染率分别为47.11%，44.38%，34.99%、33.01%、30.30%和18.60%(图2)。方差分析结果表明，ZY和PW此2个处理侵染率极显著高于其他处理(P<0.01)，WZS、JG和WYJ 3个处理侵染率极显著高于MJ(P<0.01)。

图1 思茅松苗木菌根的形成及不同形态

图2 不同来源菌根土接种对思茅松幼苗菌根侵染率的影响

2.2 接种处理对思茅松幼苗生长的影响

经接种处理思茅松幼苗的高径生长量如图3所示。ZY、PW、WZS、JG、WYJ和MJ等各处理的幼苗株高分别为51.13、39.47、44.59、44.67、44.50 cm和21.01 cm(图3A)，地径分别为4.13、3.61、3.98、3.88、3.69 mm和2.27 mm(图3B)，对照组的株高和地径分别为23.45 cm和2.15 mm。方差分析结果表明，接种处理显著影响了思茅松幼苗的株高和地径生长，但不同来源菌根土的效应存在差异。除MJ接种处理与对照无显著差异外(P>0.05)，其余5个来源的菌根土接种后幼苗的苗高均极显著高于对照(P<0.01)，效果最为显著的是ZY接种处理，较对照提高了118.04%，而JG、WZS、WYJ和PW接种处理的幼苗，其苗高较对照也分别提高了90.49%、90.15%、89.77%和68.32%。对地径生长的效应，除MJ接种处理与对照无显著差异外(P>0.05)，接种其余5个处理均极显著高于对照(P<0.01)，特别是接种ZY处理的幼苗，其地径较对照提高了92.09%，而WZS、JG、WYJ和PW接种处理的幼苗，其地径较对照也分别提高了85.12%、80.47%、71.63%和67.91%。

图3 不同来源菌根土接种处理对思茅松幼苗生长量的影响

2.3 接种处理对思茅松幼苗生物量积累的影响

经接种处理思茅松幼苗的生物量如图4所示。ZY、PW、WZS、JG、WYJ和MJ接种处理的幼苗地上部分生物量分别为2.89、1.63、3.03、2.74、2.84 g和0.64 g，地下部分生物量分别为0.81、0.71、0.75、0.50、0.63 g和0.20 g，而对照组的地上和地下部分生物量分别为0.63 g和0.18 g。方差分析结果表明，除MJ接种处理与对照无显著差异外(P>0.05)，接种其余5个来源的菌根土幼苗地上部分生物量均极显著高于对照(P<0.01)，尤其是WZS处理的幼苗，其地上部分生物量较对照提高了380.95%，而ZY、WYJ、JG和PW接种处理的幼苗，地上部分生物量分别较对照提高了358.73%、350.79%、334.92%和158.73%。除MJ接种处理与对照无显著差异外(P>0.05)，接种其余5个来源菌根土幼苗的地下部分生物量均极显著高于对照(P<0.01)，尤其是ZY接种处理的幼苗，其地下部分生物量比对照提高了350.00%，而WZS、PW、WYJ和JG接种处理的幼苗，地下部分生物量较对照分别提高了316.67%、294.44%、250.00%和177.78%。

2.4 接种处理对思茅松幼苗叶绿素含量的影响

由图5可知，不同来源的菌根土接种对思茅松幼苗针叶叶绿素含量的影响较大。与对照相比，MJ、PW、JG、WYJ、ZY和WZS接种处理其幼苗针叶的叶绿素b(Chl b)含量分别提高了46.48%、23.74%、21.21%、17.96%、12.91%和2.98%；JG、MJ、WZS、PW、ZY和WYJ接种处理其针叶的叶绿素a(Chl a)含量分别增加了74.27%、62.56%、46.99%、42.19%、40.96%和27.12%。菌根的形成显著增加了思茅松幼苗叶绿素总含量，与对照处理相比，接种MJ、JG、PW、ZY、WZS和WYJ处理其幼苗叶绿素总含量(Chl t)分别增加了56.41%、54.00%、35.14%、30.24%、30.17%和23.62%。

图5 不同来源菌根土接种对思茅松幼苗叶绿素含量的影响

3 讨论

在林木育苗阶段接种菌根真菌，可显著提高苗木成活率和苗木质量，缩短上山造林缓苗期，并促进幼树生长[21]。本研究中，菌根化的思茅松幼苗各项生长指标和针叶的叶绿素含量显著高于对照，表明外生菌根真菌在不同程度上促进了思茅松苗木的生长，事实上，已有大量研究证实外生菌根真菌能够促进松属树种苗木对养分和水分的吸收[22-24]。

本研究还发现，根系菌根侵染率最高的接种处理(ZY)，苗木的高、地径和地下部分生物量均为所有接种处理中最高，这在一定程度上可以说明，菌根形成率高加大了宿主植物根系吸收面积，从而对宿主植物的促生效果较明显[13]，菌根侵染对苗木高、径生长和地下部分生物量具有积极的作用，这与其他研究者在樟子松上的研究结果相符[4，25]。

已有很多研究表明，菌根真菌对林木幼苗的促生效果以及林木菌根生长响应因菌种或菌株而异，不同接种体的效果不同[9，26-27]，发掘和筛选高效促生的外生菌根真菌资源，是菌根技术应用于生产实际的基础性工作。本研究证实取自云南6个分布点的思茅松菌根土均能与思茅松苗木形成外生菌根，且其中5个地点的菌根土对思茅松苗木的生长和生物量的积累均具有显著的促进效应。结合林木轻基质育苗，加入少量的菌根土是一种简便易行的方法，然而该方法在实际中的应用也会受到一些限制，生产中应现用现采，因为随着储存时间的延长，天然菌根土的接种势会显著下降，另外还存在接种效果不一致的情况[17]。本研究对云南省主要的思茅松分布和栽培地外生菌根真菌在苗木培育中的应用潜力进行了探索，下一步将针对接种效果好的林下及根际土壤中的外生菌根真菌多样性进行深入研究，分离培养和筛选优良菌种，扩繁制备标准化的思茅松菌根菌剂，研发苗木菌根化的配套技术措施，从而更好地促进思茅松菌根化壮苗的培育。