思茅松高世代育种策略研究*

李江，陈伟，陈少瑜，罗婷，冯弦，陈绍安，姜远标

(1.云南省林业和草原科学院，云南 昆明 650201；2.国家林业草原思茅松工程技术研究中心，云南 昆明 650201)

思茅松(Pinuskesiyavar.langbianensis)，集中分布于云南哀牢山以西，澜沧江以东，直至西双版纳州北缘。1 100～1 600 m的帚状高原面是思茅松的集中分布区，包括景东、墨江、镇沅、景谷、宁洱、思茅和澜沧等县区。除普洱市外，云南的临沧、西双版纳、保山、玉溪和德宏等州市均呈零星分布。越南、老挝、缅甸、泰国和印度等国也有分布[1-3]。普洱市现有思茅松总面积1 247 071.1 hm2，其中人工林223 608.7 hm2，天然林884 887.4 hm2，人工促进天然更新林138 575 hm2(云南省林业调查规划院，云南省森林资源调查报告，2016年)。云南普洱依托思茅松兴建了林浆(纸)产业、林板产业和松脂产业等发达的林产工业体系，相关产业税收居于全省龙头地位。普洱市正在全力推进“全国重要现代林产业基地”建设，加速发展千亿元规模的林浆纸和林板产业。总体看来，普洱林产业对资源的依赖性很强，普洱林产业长远发展取决于原料能否有效供给，出路在于大力发展思茅松工业原料林，加强以良种为核心的原料林集约化培育，大幅度提高产量和原料质量。

思茅松每年可生长2～3轮[4]，是我国生长最快的松属树种，遗传改良的空间与潜力很大。但是，从20世纪90年代完成思茅松第1轮遗传改良以来，长期停滞不前，严重落后于省外用材树种的改良水平。国内杉木(Cunninghamialanceolata)已完成了第3代改良，进入第4代育种；马尾松(Pinusmassoniana)、油松(P.tabuliformisCarrier)、华北落叶松[Larixgmeliniivar.principis-rupprechtii(Mayr)Pilger]、红松(P.koraiensisSiebold et Zuccarini)和樟子松(P.sylvestrisvar.mongolicaLitv.)等针叶用材树种的第2代遗传改良已经比较深入，随着国家新一轮林木良种选育计划的开展，杉木和马尾松等主要针叶用材树种将开始更高世代遗传改良[5]。现有思茅松种子园都是第1代或1.5代，先后收集保存的思茅松种质资源家底不清、用途不明，思茅松杂交育种缺乏系统的规划，有限的育种资源因很多低水平重复研究，造成不同程度的浪费。为了尽快实现思茅松良种升级换代，遗传改良研究持续合理发展，迫切需要制定符合思茅松实际、合理可行的长期育种策略。

1 林木遗传改良研究现状

1.1 思茅松遗传改良的基本概况

思茅松遗传改良工作始于20世纪80年代初期(1989年)，云南省林业科学院的赵文书、李莲芳等研究者，在云南省科委和省林业厅林木良种专项资金支持下开展了思茅松优良种源选择、天然优良林分选择和思茅松无性系种子园营建技术研究，1993年在普文试验林场建成云南省第一个思茅松初级无性系种子园[6-8]。普文思茅松种子园从1997年开始陆续提供良种用于生产。该种子园是思茅松第1代遗传改良的标志性成果，在云南省思茅松人工林培育中发挥了重要作用。普文思茅松初级无性系种子园建成后，根据普文种子园半胞子测林测定结果，逆向选择出一批1代优树无性系[9]，以这批材料作为建园材料，先后在景谷、镇沅、景洪和澜沧等地建成5个思茅松1.5代的材用种子园，其中景洪市普文试验林场思茅松种子园和普洱市景谷县文朗试验林场的思茅松种子园种子已通过良种审定，入选国家长期林木良种基地，此期营建的半胞子测林还成为2代育种材料的一个重要来源。思茅松种子园良种已经在云南省推广造林面积10×104hm2以上，在生产上发挥了重要作用，在第2代思茅松种子园建成投产前，该种子园生产的良种还将发挥重要作用。

从20世纪90年代，第1个思茅松初级无性系种子园建成后，以云南省林业和草原科学院为主的相关研发机构围绕思茅遗传改良持续开展研究。唐社云[10]和段安安等[11]对思茅松种子园的丰产结实管理技术进行了初步探索，具体措施有断顶、施肥和人工促进授粉等，陈少瑜等对普文思茅松初级种子园的遗传多样性开进行了首次研究[12-13]。在云南省科技攻关项目“思茅林区现代林产业发展综合技术集成研究与示范”(2004—2009年)支持下，李江等[14]开展了思茅松快繁技术研究，开发出标准化的思茅松扦插繁殖技术，制订了相关技术标准。在云南省科技攻关项目“思茅松可持续经营技术研究与示范”(2001—2004年)和国家发改委“云南思茅松良种高技术产业化示范”(2008—2011年)等项目支持下，蒋云东等[15-18]开展了思茅松高脂优树选择、自由授粉家系高脂良种选育、高脂无性系测定等研究，并在镇沅县建成云南省首个思茅松高产脂无性系种子园，选育了一批高产脂良种。在国家林业公益性行业专项“高产脂思茅松良种选育及功能基因克隆与鉴定(2013—2017年)”支持下，开展了高脂优树选择、高脂无性系选育和高脂原料林定向培育试验，开发专属的SSR引物12对，克隆获得一批思茅松产异基因和转录因子，开展了DXS、HDR和GGPS等产脂相关基因的功能分析[19-22]。

思茅松的遗传改良工作与马尾松等树种同期起步，但是因为投入的人力和财力不足、研究力量分散，加之缺乏长期育种策略等原因，思茅松总体上长期停滞于第1代遗传改良阶段，多数良种工作都是对第1代育种成果的推广与应用。与思茅松培育研究发展较快[23-24]不同，直到2007年，蒋云东等[17]分别以高脂和速生作为改良目标，开始思茅松杂交育种探索，初步掌握了思茅松杂交育种技术。2017年开始，云南省林业科学院启动自主创新项目“思茅松2代育种群体构建(2017-2020年)”，对思茅松第1代育种成果进行了系统整理，选育出7个‘云林’系列思茅松半同胞子家系良种和一批半胞子代优良材料，使遗传增益在思茅松初级种子园的基础上，有了较大提高，相关良种已在‘云景林纸’等龙头企业开始规模化推广应用。近年来，云南省林业和草原科学院的“用材林培育研究团队”先后获得云南省重点研发计划和省种子种业联合实验室首席专家项目等育种专项支持，当前正在全力推进以2代育种群体构建为核心的思茅松杂交育种工作，思茅松育种正式步入高世代遗传改良的全新阶段。

1.2 高世代育种策略解决的主要问题

林木育种策略(tree breeding strategy)是针对某个特定树种的育种目标，依据树种的生物学和林学特性、遗传变异特点、资源状况和已取得的育种进展，并考虑当前的社会和经济条件，可能投入的人力、物力和财力，对该树种遗传改良做出的长期的总体安排[25]。国际上，主要林业发达国家对重要林木都在坚持基于轮回选择不断推进以选择、交配、遗传测定为核心的育种循环，完成更高轮次的基本群体、育种群体、选择群体和生产群体建设，这是林木可持续遗传改良的根本所在。在此基础上，采用转基因和基因编辑等分子育种技术，进一步改良已有林木品种或优异种质等，推动林木育种理论和技术创新，提高育种效率和效果，选育产量更高、品质更优、抗逆性更强、适应性更广的林木良种并应用于生产[26]。为了实现思茅松育种尽快实现升级换代，并能持续发展，迫切需要制定一个符合思茅松实际、合理可行的思茅松长期育种策略，实现思茅松初级世代育种和高世代育种的有机衔接，在全面整理初级育种成果的基础上，指导思茅松高世代育种长期有序的开展。为此，本研究按照林木育种基本群体、选择群体、育种群体和生产群体的基本概念和建设要求对思茅松育种进行梳理，以选择、交配和遗传测定为核心，对思茅松育种策略进行探讨和研究，以推动云南省思茅松高世代育种工作持续规范地发展。

思茅松高世代育种策略主要解决以下问题：一是分别依照基本群体、选择群体、育种群体和生产群体的现代林木育种理念对现有思茅松育种材料进行系统梳理，厘清育种材料的现状，实现对种质资源的科学管理；二是借鉴马尾松和杉木等树种的高世代育种经验，深入研究思茅松树种特点，提出相关群体建设目标与构建技术，对高世代遗传改良进行总体规划；三是以思茅松2代育种群体构建为核心，制定杂交、分子辅助育种、遗传测定等具体技术方案，以加快思茅松高世代遗传改良进程。

2 思茅松高世代育种策略的主要内容

2.1 总体技术路线

如图1所示，思茅松第2代遗传改良基本上可以划分为三个阶段。第一阶段是创建2代遗传改良基本群体，3个途径包括利用第1代育种群体开展杂交创制全同胞子代，纳入全部现有思茅松半同胞子代林和补充外部优树资源。第二个阶段是选择和组建选择群体与育种群体，通过遗传测定从全同胞子测林和半同胞子测林中选择2代优树，补充部分其它优树后建立2代选择群体和育种群体；测定的同时选育家系良种。第三个阶段是建设相关的育种基地，包括：建设种质资源库保存选择群体与育种群体，以实现优良种质的长期保存利用；建设2代育种园，矮化保存第2代核心育种群体，为下一轮育种提供便利的杂交育种场所及亲本材料；建设2代种子园，建立生产群体，生产高世代良种；最后，营建良种示范林，及时将本轮遗传改良新成果进行示范推广。需要指出，思茅松2代遗传改良是不断完善的长期过程，不同阶段主要任务各有侧重，但各个阶段的工作也会有交叉。

图1 思茅松第2轮遗传改良总体技术路线

2.2 基本群体的组建计划

思茅松第1代遗传改良的基本群体为云南省思茅松分布区内所有的思茅松天然林单株。第2代遗传改良基本群体为第1代优树的自由授粉半同胞子代和第1代育种群体的全同胞杂交子代，现有思茅松半胞子测林中有3万多株，全胞子测林计划种植约5万株以上。现代林木遗传改良实践中，代际区分不是非常严格，根据多目标性状改良需要，现有收集保存的高脂、长节、细枝、多花和高抗等种质资源也都纳入思茅松第2代遗传改良基本群体，约2×104个单株。思茅松第2代遗传改良基本群体预计约为10×104个基因型。

2.2.1 杂交创制全同胞子代

(1)第1代育种群体 育种群体来源于选择群体的部分或全部优树，通过基于不同交配设计的基因重组获得遗传增益提高的遗传变异。林木遗传改良的根本任务是持续提高林木的整体遗传品质，每1轮育种群体的遗传多样性都应该维持在一个合理的水平，才能避免育种材料的遗传基础不会随着代数增加越来越窄，保证育种群体的合适规模也是减少子代共祖率的有效手段。思茅松作为集中分布的地方性树种，人工造林面积大，遗传多样性容易丧失。这对遗传改良工作提出了更高要求，既要不断选育高遗传增益的良种，又要注意在每一轮改良中维持合理的遗传多样性，确定育种群体的规模非常重要。总的原则是在研究思茅松全分布区基本群体遗传多样性的基础上，将其作为确定育种群体规模的重要参考指标，此外，结合育种材料和育种规模合理确定育种群体规模。育种群体的遗传多样性要占本轮基本群体多样性50%以上。据此，课题组利用普文试验林场思茅松半胞子代测定结果，根据育种值逆向选出40个思茅松优良无性系，再补充第1轮优树选择漏选的澜沧种源优树后[27]，开展基于SSR分子标记的亲缘关系分析，对第1代思茅松育种群体进行结构划分，亲缘关系较近的划分在相同的亚系和育种组。最终分为2个亚系，8个育种组(每组6～7个无性系)共50个无性系组成思茅松第1代核心育种群体。

(2)交配设计 杂种优势是指两个遗传性不同的亲本杂交所产生的亲本一代在生长势、生活力、抗逆性、产量和品质等方面比双亲优异的现象[26]。为充分利用杂种优势，同时控制杂交规模以减少劳动力，借鉴国内马尾松的高世代遗传改良经验[5]，思茅松高世代育种群体杂交育种交配以测交设计为主，并以不同亚系组间的正向和反向测交为主。但是，根据研究需要也可采用不连续双列杂交、全双列和半双列交配设计。

2.2.2 营建全同胞子代测定林

测定是林木育种循环的一个重要环节，杂交获得的全同胞子代测定林是高世代改良基本群体的重要组成部分，进而通过子代遗传测定划分出选择群体和育种群体。思茅松集中分布于云南南部山区，受山地地形限制，全同胞子代测定林的规模不宜过大，一个完整测定的家系数量在40～50株为宜，采用5株小区，8～10次重复。造林的株行距以3 m×2 m为宜，相同小区的5棵单株在同列上顺坡布设，当林地边缘长度不足5株时，另起一列种植，林缘空地种植保护树，以确保同1个5株小区所有单株都处于同一列上不串列。重复内，可随机安排参试家系，排完1个重复后，接着开始下1个重复。造林完成后，用不同规格的水泥桩设置永久标识，标记每个试验重复和小区，绘制详细的家系定植图。这种试验布置方法具有操作方便、节约用地和后期调查定位简单的优点，比较适宜云南山地地形应用。

2.2.3 半同胞优树选择

分别在景洪普文试验林场、景谷文郞林场和澜沧现有的思茅松半胞子测林中开展2代半胞优树选择，基于生长量采用混合选择与配合选择相结合的方法，配合选择家系入选率20%，单株入选率15%；混合选择单株入选率2%，计划从思茅松半胞子代林中选取100个左右优树无性系纳入二代育种群体。

2.2.4 外部优树增选

在2代育种群体选择中，除了从全胞子测林和半胞子测林子代中选择外，一些具备高脂、长节、高碳、高抗和其它突出优良性状的优树，也纳入2代育种群体。

2.3 选择群体、育种群体组建计划

2.3.1 选择群体

选择群体主要由基本群体中挑选出来的优树组成，一般包括几十个到上千个基因型。思茅松第1代选择群体优树分别保存于3个思茅松种子园优树收集区和普文思茅松种质资源库。包括材用优树478个无性系，分别保存于普文种子园优树收集区、澜沧种子园优树收集区和普文种质资源库；思茅松脂用优树656个无性系，分别保存于普文林场思茅松种质资源库、景谷和宁洱高脂优树收集区。

思茅松第2代遗传改良的选择群体来源以半胞子测林和全同胞子测林为主，采用配合选择和混合选择方法，计划从已有思茅松半同胞子测林中选出优良家系优良单株约150株；通过杂交创制约1 000个全同胞家系，在景谷、景洪和思茅等地营建3～5块全同胞子测林，从全胞子测林中选择优良家系优良单株约500株，补充其它外部优树100株，组建约750个无性系的第2代选择群体。

2.3.2 2代育种群体

(1)选择方法 二代育种群体选择，分别在景洪普文林场、景谷文朗林场和澜沧现有思茅松半胞子测林开展半胞优树选择，基于生长量采用混合选择与配合选择方法进行选择，配合选择家系入选率20%，单株入选率15%；混合选择单株入选率2%，计划从思茅松半胞子代林中选取150个左右优树无性系纳入第2代选择群体，精选100个进入第2代育种群体。从全胞子代中选取500个优树无性系纳入第2代选择群体，选择其中250个无性系纳入第2代育种群体。此外，还会纳入部分补充的外部优树。

(2)结构划分 思茅松第2代育种群体正在创建中，主要来源包括自由授粉子代和全同胞子代。近期，将从现有思茅松半胞子测林中选取第2代优树，通过基于SSR分子标记技术划分亚系(subline)和分组，利用半胞子代优树组建3～5个亚系、每个亚系3～5个组，每个组6个无性系，合计约100个无性系。今后的研究方向，是分期分批地对利用第1代核心育种群体亲本杂交所得到的子代开展遗传测定，计划通过杂交创制约1 000个全同胞家系并开展子代测定工作，计划在10年内，从全胞子测林中筛选250个左右的优树无性系纳入第2代育种群体，划分为10个左右亚系，每个亚系4～5个组，每个组6个无性系。补充的外部优树组成约2～3个亚系，每个亚系4～5个组，每个组6个无性系。最终再从第2代育种群体中选出60个无性系组建核心育种群体，初步计划将其分为3个亚系，每个亚系3～4组。育种群体和核心育种群体的规模分别满足基本群体遗传多性的70 %和50 %以上，第2代核心育种群体是2代种子园建园的主体材料和更高轮次育种的骨干亲本。

2.4 良种选育

思茅松优良家系选择，通过半胞子代测定和全胞子代测定开展优良家系选择，及时审(认)定良种用于生产推广，家系入选率为10%，入选家系的变异系数较小。

2.5 分子辅助育种

从20世纪90年代以来，思茅松分子生物学研究方面陆续开展了一些工作，陈少瑜等[12]最早用等位酶分析方法对普文思茅松种子园进行了遗传多样性和遗传结构分析。赵能等[19]对思茅松EST-SSR标记进行了系统识别，并开发了专属、稳定有效的标记引物。王毅等[28-30]克隆获得了思茅松DXS、HDR和HMGS等基因，通过功能分析发现松脂代谢与这3种基因密切相关。

近年来分子技术在林木育种中的应用越来越广，现代分子生物技术日新月异，从长远来看，设计育种和基因编辑等新技术在林木育种上应用潜力很大[31]，但是分子辅助育种的成功范例极少。这是因为林木目标性状大多属于数量遗传，基因与环境互作效应显著，加之分子标记与QTL(数量性状基因座)间低水平连锁因素，分子标记辅助选择难以取得较表型选择更好的效果[26，32]。因此，在思茅松分子辅助育种的研究上，坚持必须且有效的原则，现阶段分子辅助育种研究主要用于遗传多样性分析，基于亲缘关系辅助亲本选择和育种群体结构划分。下一步，将利用两个途径加强分子标记研究，通过基因型鉴定，缩短育种周期。一是研究通过高密度分子标记遗传连锁图谱构建及重要数量性状的QTL定位，将影响数量性状的多个基因剖分开，并寻找与其紧密连锁的分子标记，建立了表型性状与分子标记之间的联系。二是开展通过组学分析(转录组、代谢组及基因组)对重要经济性状的分子机理解析，找到与性状相关功能基因，通过基因组测序找到多态性位点，研发重要的经济性状分子标记。

2.6 育种基地建设

2.6.1 种质资源库

种质资源是林木育种基础，建设种质保存库以便于长期保存思茅松种质资源是合理可行。在现有基础上，计划在景洪普文热带林业研究所建立思茅松种质资源库(主库)，在普洱景谷建立种质资源资源库(副库)，保存思茅松第1代和第2代的选择群体与育种群体。在区划上，第1代材料主要参考地理种源分区；第2代材料主要基于亚系和育种区开展分区。此外，单独设立高脂和长节等优良种质收集区。每个优良无性系，嫁接保存10个无性系分株。

2.6.2 高世代育种园

现在思茅松的杂交试验主要在普文思茅松种子园和景谷云景林业开发公司开展。思茅松的第1代遗传改良的种子园同时承担生产群体和育种群体的功能，同一无性系分散布置，且因矮化不到位、树体高大(16～20 m)，导致杂交工作非常费时困难，需使用高空作业车载人进行杂交作业，存在一定作业危险，人工授粉效率不高。在思茅松第二代遗传改良中，生产群体和育种群体将分别建立，计划在景谷和普文同时建设思茅松育种园保存第2代核心育种群体。育种园根据亚系和育种组进行分区，同一无性系分株集中配置，并及时开展树体矮化修剪，培养矮化丰产树形，方便花粉采集和人工控制授粉，提高育种效率。

2.6.3 高世代种子园

思茅松林是云南南部重要的地带性植被，人工林经营周期在15～30年，除了纸浆、林板和松脂工业原料林营造外，还有相当大规模的生态林营建任务。在持续提高思茅松遗传品质的同时，还要保持合理的遗传多样性，这就决定了思茅松的遗传改良不能走遗传型单一的无性系之路，采用可持续的多轮遗传改良是更为合理的选择，通过多轮改良不断提高基本群体的遗传品质，为思茅松人工林质量提升奠定坚实基础。当然，在早期遗传改良阶段，采用有性创造、无性利用的途径，选育一些无性系良种用于工业原料林集约化培育也是很有价值的。但高世代种子园还应是提供思茅松用材林良种的主要形式。根据建设条件和尽快将高世代良种投入生产的原则，可以分阶段建设思茅松高世代种子园。第一阶段是结合育种园的建设，利用第2代育种群体中现有半胞子代优树建设临时的思茅松第2代种子园。第二个阶段是当思茅松第2代育种群体组建完成后，开展思茅松第二代种子园建园材料初选，基于亲缘关系分析对第2代育种群体进行亚系和育种组划分，同一个亚系内选择材积生长量在前10的无性系作为思茅松第2代种子园的建园材料，但是来自同组无性系不得超过2个。此外，也可利用数组配合力最高的无性系建立生产性种子园，为高度集约化经营的工业原料林营建提供良种。

3 结语

在对思茅松第1轮遗传改良情况系统回顾的基础上，参考国内外相关经验与主流做法，研究提出了思茅松高世代遗传改良育种策略。在高世代遗传改良策略研究中，明确了思茅松高世代遗传改良的总体技术路线，分别按照林木遗传改良基本群体、选择群体、育种群体和生产群体的概念对第1轮遗传改良情况进行了梳理，对高世代遗传相关群体的建设进行了系统规划。本文首次提出思茅松高世代育种策略，对该树种的遗传改良做出长期规划与具体安排，有助于解决思茅松育种工作零散和低水平重复等问题，对推进其高世代遗传改良有望发挥积极作用。最后，这个策略也是一个开放的育种计划，随着育种技术发展和遗传改良工作推进，可对育种策略进行必要优化，但局部的调整不会影响其对思茅松长期改良的总体指导作用。