全自动间断化学分析仪在苗木氮、磷测定方法中的优良性研究*

陈诗，母德锦，王瑜，陈林，唐军荣，蔡年辉，许玉兰，李孙玲

(1.西南林业大学 西南地区生物多样性保育国家林业和草原局重点实验室，云南 昆明 650224；2.西南林业大学 西南山地森林资源保育与利用教育部重点实验室，云南 昆明 650224；3.云南省林业和草原科学院，云南 昆明 650201)

氮、磷是植物中核酸、蛋白质以及细胞结构的主要组成营养元素，不仅在植物的生长发育和各种生理机制调节过程中起到重要的作用，还参与到了地球化学循环[1-2]。前人的研究表明，植物叶片中的氮、磷化学计量特性变化，可作为判别植物受养分限制的依据[3]。因此，准确测定植物叶片中氮、磷含量，对于植物营养分析与评价、水肥管理以及植物生态适应策略有着重要意义[4-6]。植物全氮、全磷含量测定的经典方法分别是凯氏定氮法和钼锑抗比色法[7]。但传统的测定方法操作繁琐、受人为影响较大、检测分析效率较低、较难满足快速批量测定的要求。近年来仪器检测技术得到了越来越多的应用[8-11]，但是凯氏定氮仪、分光光度仪、元素分析仪等仪器不能同时满足氮、磷含量的测定，使用效率降低，而流动分析仪虽可同时测定氮、磷元素含量，却因价格高昂以及对机器维护保养以及模块更换要求高而使用率低。

SmartChem 200全自动间断化学分析仪是最近几年来离子分析仪器领域中新突破，能够同时测定氮、磷元素含量，因其操作简便，检测准确度高，价格适中等优点得到了环保、农林、水产行业等领域的青睐。前人对该仪器的测定方法研究多集中在水质监测[12-13]、食品营养[14-15]、土壤元素[16]等方面，而对植物叶片中氮、磷元素测定方法研究较少。因此，本研究以西南林业大学智能温室大棚1 a生云南松(Pinusyunnanensis)苗的根、茎、叶器官为测试材料，应用SmartChem 200全自动间断化学分析仪进行测定，建立同时测定植物叶片中全氮、全磷含量的方法，并将实验结果与传统方法结果做比较，验证该仪器的优良性，以期为批量测定植物中全氮、全磷的研究提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

2022年9月于西南林业大学智能温室大棚云南松苗圃采集1 a生云南松针叶样品14份、茎样品14份、根样品14份，共42份样，依次编号1～42号。采样后将植物材料在120 ℃烘箱杀青30 min，再80 ℃烘至恒重，粉碎机研磨后将过孔径100目筛的颗粒干燥备用。

1.2 主要仪器

SmartChem 200全自动间断化学分析仪，万分之一电子分析天平，烘箱，LWY84B型远红外消煮炉等。

1.3 药品

酒石酸钾钠、过氧化氢、氯化钾、水杨酸钠、氢氧化钠、硝普钠、次氯酸钠、十二烷基硫酸钠(SDS)、半水合酒石酸锑钾、酒石酸锑钾、抗坏血酸、氢氧化钾、四水钼酸铵、二氯异氰尿酸钠、三羟甲基氨基甲烷、曲拉通、异丙醇、聚氧乙烯月桂醚。按照仪器说明书方法配置针洗液、稀释液、酒石酸锑钾溶液、TPA试剂、TPB试剂、TPC试剂、磷50 mg/L储备标样、氮60 mg/L储备标样、TNA试剂、TNB试剂、TNC试剂。

1.4 实验方法

1.4.1 实验原理

通过浓硫酸的消煮过程，将处于游离状态的氨根离子、有机氮和氮元素转化形成硫酸铵。氨与次氯酸盐和水杨酸盐反应会生成与氨浓度成正比的蓝色物质，加入硝普钠能够增加显色程度，酒石酸钾钠则能够消除钙离子、镁离子等的影响，其中的红色络合物在660 nm波长处有最大吸收，可测定其吸光度，由此计算氮的浓度。磷在酒石酸锑钾存在的条件下会与钼酸铵反应生成淡黄色的磷钼酸铵复合物，再用还原剂抗坏血酸还原生成深蓝色的钼蓝，于880 nm波长处测定吸光度，计算磷的浓度。

1.4.2 样品的处理

基于陈剑磊等[16]的方法改良。称取0.20 g植物样品倒入消煮管中，加入1.5 mL去离子水润湿后，再加入5 mL 98%浓硫酸，使用振荡器摇匀使其充分碳化。将装有碳化后样品的消煮管置于远红外消煮炉中消解并将温度调至80 ℃，待消煮炉温度上升至80 ℃时向消煮管内加入5滴30%过氧化氢。按此方法每间隔30 min将消煮炉温度升至160、240、280、320 ℃，过氧化氢量逐次减少直至消煮管内液体澄清，340 ℃时需加热5～10 min。除不加样品液外，空白试验也照此方法进行。待消煮管自然冷却后，用去离子水将管内液体冲洗入50 mL容量瓶并定容。过滤后的上清液按氮500倍、磷100倍稀释备测。

1.4.3 上机步骤

待电脑和SmartChem 200全自动间断化学分析仪开机预热15 min后，依次在反应池中添加样品、1%硫酸稀释液、针洗液、标样试剂、TNA试剂、TNB试剂、TNC试剂、TPA试剂、TPB试剂、TPC试剂以及测标曲需要的5个空样杯。

在全自动间断化学分析控制软件上选用0～12 mg/L(以N计)测量范围设定参数，将滤光片Filter1设定为660 nm并启用Fluidics，设置样品量30 uL、TNA试剂290 uL并延时36 s、TNB试剂64 uL并延时36 s、TNC试剂32 uL并读数612 s，机器可自动将标准氮稀释为0、0.6、1.2、2.4、4.8、9.6、12.0 mg/L系列标准液。全自动间断分析仪先按照上述检测条建立全氮的标准曲线：Y=18.059 9X+0.007 5(R2=0.999 9)。

选取以0～5 mg/L(以P计)测量范围设定磷的标曲参数。将滤光片Filter1设定为880 nm启用Fluidics，设置样品量48 uL、TPA试剂292 uL并延时36 s、TPB试剂56 uL、TPC试剂24 uL并读数576 s，系统会自动将标准磷稀释为0、0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、5.00 mg/L系列标准液。按上述检测条件进行测定，全磷的标准曲线：Y=8.476 0X-0.1707(R2=0.999 4)。然后对样品进行自动检测分析，分析结束后将测定结果导出计算含量。

1.5 结果计算

全氮计算公式如下。

W=C×0.5/M

①

全磷计算公式如下。

W=C×0.1/M

②

式中：W为氮、磷元素含量，单位g/kg；C为机器测定出的吸光度值根据标准曲线计算的氮、磷浓度，单位mg/L；M为样品质量，单位为g。

加标回收率的计算公式如下。

R(%)=(Cs-C)/S×100

③

式中：R是回收率，Cs为加标样品含量，C为样品含量，S为加到样品中的分析物量。

精确度实验中，选定的样品消煮液重复测定3次；测定值Xi的算术平均值为样品元素含量的估测值，用贝塞尔公式计算标准偏差SD，即

④

RSD=SD/计算结果的算术平均值×100%

⑤

式中：xi为测定值，SD为标准偏差，RSD为相对标准偏差。

1.6 统计分析与数据处理

应用Microsoft Excel 2013进行数据处理，并利用直线回归方程作图分析全自动间断分析仪和传统方法测定植物全氮、全磷含量的相关性及显著性，采用Spss 18.0软件对不同方法测定的数据进行配对t检验和差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 全自动间断分析仪与传统方法所测植物全氮、全磷的比较

本实验中所用的42个云南松苗各器官样本全氮含量在5.935～14.960 g/kg之间，全磷含量在1.442～2.426 g/kg之间。由表1可知凯氏定氮仪与全自动间断分析仪测定的全氮平均含量为10.108 g/kg和10.020 g/kg，双侧t检验，P(T≤t)=0.128，表明实验中所用的2种方法测定的相同材料全氮含量差异不显著。钼锑抗比色法与全自动间断分析仪测定的全磷平均含量为1.916 g/kg和1.908 g/kg，双侧t检验，P(T≤t)=0.397，表明实验中用同2种方法测定的同种植物材料样品全磷含量无差异。

表1 传统方法与全自动间断分析仪测定植物全氮、全磷含量t检验

2.2 全自动间断分析仪与传统方法所测全氮、全磷含量的相关性

由图1可知，全自动间断分析仪与凯氏定氮仪所测定全氮含量拟合的回归方程为Y=0.982 8X+0.261(R2=0.979 3)，因此2种方法所测定的全氮数值相关性极显著(P<0.01)。全自动间断分析仪与钼锑抗比色法测定的全磷含量所拟合的回归方程Y=1.091 9X-0.167 7(R2=0.966 7)，进一步说明2种方法测定的全磷含量相关性极显著(P<0.01)。2个方程的斜率分别是0.982 8和1.091 9，比较趋近于1，表明全自动间断分析仪与传统方法所测定的全氮、全磷含量结果较一致。

图1 全自动间断分析仪与传统方法测定植物全氮、全磷含量的相关性

2.3 全自动间断分析仪测定全氮、全磷含量回收率与精确度分析

以其中3个样品(11号、17号、32号)为本底，加入NH4CL 100 mg/L标准氮和KH2PO450 mg/L标准磷进行回收率测定方法的验证。在相同条件下，按照表2量进行加标回收实验。结果表明，全自动间断分析仪测定全氮的回收率(R)为98.900%～101.850%，全磷的R为96.100%～105.200%。说明全自动间断分析仪同时测定全氮、全磷的准确度较高。

表2 全氮、全磷的加标回收率实验结果

在相同测定环境下，用全自动间断分析仪对11号、17号、32号的样品全氮、全磷平行测定3次，结果见表3。全氮的相对标准偏差(RSD)为2.020%～2.790%，全磷的RSD为0.250%～1.280%，由此可见该方法对植物全氮、全磷测定的精密度较高，结果稳定。

表3 全氮、全磷平行测定结果

3 讨论与结论

3.1 讨论

测定植物全氮、全磷含量，无论是应用传统测定方法还是自动化仪器测定方法，首先都需要将样品材料预处理成待测液，再进行测定。而待测液的制备所需要消耗的时间和精力成本往往比含量检测消耗得更多，样品材料的消煮过程将直接影响到元素含量测定的准确性。本研究虽然选用硫酸-过氧化氢对干样进行消煮，但在消煮温度上采用阶梯式增温的方式，而非直接370 ℃消煮[17-18]。因此，避免了直接过高的温度导致消煮管中的液体一直沸腾放热，样品容易喷溅到消煮管壁上，导致消煮不完全而造成材料损失影响精度的，同时给检测人员带来危险，污染周围环境等情况。消煮到320 ℃时消煮管内液体颜色透明无色，仍需在320 ℃煮10 min，此步骤可除去消煮管内剩余的过氧化氢，减少测定时的干扰[19]。

传统的凯氏定氮法测氮是将消煮液中的铵盐经过碱化后形成氨，并在浓碱作用下蒸馏将氨吸收到硼酸溶液中形成硼酸胺，加入甲基红-溴甲酚绿指示剂，用标准酸滴定的消耗量来计算出样品中的全氮含量[20]。钼锑抗比色法测磷的原理则是样品液中的正磷酸与偏钒酸以及钼酸反应得到黄色的三元杂多酸，在880 nm波长下有最大吸收，并利用其吸光度与磷酸浓度成正比关系计算磷浓度[17]。可见2种测定氮、磷含量方法的原理与全自动间断分析仪测定原理完全不相同。就测定结果比对而言，二者数值无显著的差异，并存在显著的线性关系，相对标准偏差(RSD)均小于3%，精密度均优于行业标准(10%、15%)[21-22]，说明不管是传统方法还是全自动间断分析仪方法均能准确测定植物全氮和全磷含量。

本研究所用SmartChem 200全自动间断化学分析仪由预设的程序控制，是将传统比色分析法自动化的仪器。通过全自动机器手带动取样针把药品液和待测液精准地加入比色皿中，再自动搅拌、反应，再利用双光束高精度数字检测器测定吸光度，通过标曲公式可自动计算得到相应的浓度，整理结果报告，可以有效避免人为操作误差。按照温云杰等[23]对传统凯氏定氮法的计算表明样品待测液吸取、蒸馏、滴定过程总共耗时约为6 min，按照每天测定工作时间7 h算，每天大约可检测70个样品，这其中还没有包括硼酸反应液与酸标准滴定溶液配制与标定耗时，测定过程中每个样品用量约40 mL，消耗试剂约50 mL。李萍等[17]对钼锑抗比色法测磷的计算表明从待测液加入二硝基酚指示剂后滴加氢氧化钠溶液显色开始，再到添加硫酸溶液调节溶液pH值，最后到添加钼锑抗试剂反应等待变色测定，至少需要35 min，而测定过程中每个样品用量约5 mL，消耗试剂约50 mL。全自动化学间断分析仪一次可测定最多126个样品，测定速度可达每小时200个样，测定400个样品仅需40 mL试剂，每个样品待测液用量3 mL。因此SmartChem 200全自动间断分析仪在测定植物全氮、全磷时，节省样品和试剂、减小污染，同时消除了因为人员操作和条件差异而产生的误差。

3.2 结论

与传统的凯氏定氮法和钼锑抗比色法测定氮、磷相比，SmartChem 200全自动间断分析仪测定1 a生云南松苗全氮、全磷含量无明显差异，并且与传统方法测定的数据呈显著的相关性，全氮的RSD在3%以内、全磷的RSD在2%以内，且该方法测定回收率在98.90%～101.85%和96.10%～105.20%之间。上述分析结果表明，应用SmartChem 200全自动间断化学分析仪同时测定植物样品中全氮、全磷的方法集自动进样、自动稀释、分光光度计、数据处理为一体，具有操作简单、结果准确可靠、回收率高、测量速度快、药品和样品用量少、高度自动化等优点。因此，本研究中的方法可以应用于批量检测植物全氮、全磷含量。