5个绵羊品种DLK1基因多态性与生长性状的关联性分析

孟泉禄,张明军,史金平,付玲娟,刘 婷,张全伟,成述儒

(1.甘肃农业大学 动物科学技术学院,甘肃 兰州 730070;2.甘肃农业大学 生命科学技术学院,甘肃 兰州 730070)

甘肃省地域辽阔,适合多个绵羊品种生长繁殖,且不同品种绵羊在生长繁育过程中能保持其独有的生产特性。甘肃高山细毛羊主产于甘肃省肃南县,是我国高寒山区第1个绵羊新品种,主要特点是能适应高寒牧区严酷的自然生态条件[1];蒙古羊膻味较轻、肉质鲜美和育肥增膘能力等生产性能显著,广泛分布于内蒙古和甘肃地区[2];藏绵羊是典型的中国粗毛羊品种,抗逆性强、耐粗饲[3];小尾寒羊属外来品种,生长发育快、肉用性能好,是世界著名高繁殖力绵羊之一[4];滩羊原属蒙古羊,具有耐干旱、个体大和适应性强等特性[5]。绵羊生产性能受环境影响,同时还受到遗传因素调控,挖掘与绵羊生长性能相关基因,是提高绵羊产业发展的理论基础。

DLK1(delta-like 1 homologue,DLK1)是一种父源表达印记基因,定位于人14号染色体、小鼠12号染色体和绵羊18号染色体上,其主要编码跨膜蛋白,同时对肌肉生长也具有一定的调节作用[6]。研究表明,DLK1转录和翻译产物在人类胎儿期各组织中广泛表达,出生后表现出组织特异性,仅在胰腺、垂体和肾上腺等组织中表达[7]。同其他印记基因相似,DLK1是哺乳动物生长发育的重要调节因子,其表达水平对细胞增殖和分化有显著影响[8]。Andersen等[9]通过对骨骼肌重塑过程中DLK1的表达量研究发现,DLK1在人类所有疾病中都呈上调趋势,且DLK1转录和翻译产物的表达高峰与成肌细胞分化融合的表达相一致,由此推测,DLK1可能在不同的水平和时间点参与肌肉发育和重塑的过程。Shin等[10]对处于不同生长时期鸡的DLK1克隆和序列分析发现,DLK1可能在脂肪和肌肉组织发育的早期阶段起重要作用。Waddell等[11]通过建立小鼠DLK1基因敲除和过表达模型发现,DLK1基因敲除导致小鼠出生后生长迟缓和肌肉再生能力受损;相反,DLK1过表达能抑制培养成肌细胞的增殖和增强分化。因此,DLK1可促进哺乳动物肌肉生长发育,但对脂肪组织分化和增长具有抑制作用。近年来,有研究发现绵羊的双肌臀性状也是由DLK1基因过表达所致[12],但具体有关DLK1基因参与肌肉的生长发育的机制尚不清楚[13]。本研究就DLK1基因多态性是否影响绵羊生长性能开展试验,以期寻找新的与绵羊生长性能相关的分子标记,进而为提高甘肃绵羊生产性能提供基础数据和理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验动物

本试验以甘肃省内固有绵羊品种—藏绵羊、蒙古羊、甘肃高山细毛羊、滩羊和外来品种小尾寒羊共240头为研究对象,具体来源和数量见表1。

表1 羊样品信息

绵羊不同生长期(0,1,3,6,9月龄)测定记录体质量、体高、体长和胸围等生长性能指标;9月龄颈静脉采集绵羊血液,-80 ℃冰箱保存备用。

1.2 血液基因组DNA提取

室温溶化冷冻血液样品,按照TIANamp Genomic DNA Kit试剂盒(天根生化科技有限公司)操作说明提取基因组DNA,NanoDrop 2000分光光度计测定其纯度和浓度,以1.8～2.0为参考作为纯DNA,用于后续试验,1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量,检测合格后用于下一步PCR扩增。

1.3 引物设计

根据NCBI提供绵羊DLK1基因(XM_027957404.2)CDS序列,使用Primer 3.0在线设计网站设计DLK1基因特异性引物,引物由西安擎科泽西生物科技有限责任公司合成,引物信息如下DLK1-F:5′-GGACGCTTGTTGAGTGAGTGT-3′,DLK1-R:5′-TTTGTTCAGAGTGAGAGCCAA-3′,目的片段大小216 bp。

1.4 DLK1基因的PCR扩增程序

PCR反应体系20 μL:2×Taq Master Mix 10 μL,上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL,DNA模板(80 ng/μL)1 μL,ddH2O 8 μL。扩增程序如下:95 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s,59 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,重复循环40次;最后72 ℃延伸5 min。扩增完成后使用1×TBE 缓冲液、1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物质量,凝胶成像系统观察并摄片。

1.5 DLK1基因多态性PCR-SSCP分析

SSCP基因分型反应:4 μL PCR扩增产物和6 μL变性缓冲液振荡混合均匀,98 ℃金属浴变性10 min,结束后快速置于冰盒中冷却10 min完成变性;之后将变性产物迅速注入凝胶孔,待样品沉入胶孔底部,150 V恒压电泳;至2条DNA单链分开后,增加电压至180 V于含1×TBE的聚丙烯酰胺凝胶中电泳6 h。

为使条带更清晰可视化,对电泳产物进行银染显型,凝胶成像仪摄片。挑选不同基因型个体送至西安擎科泽西生物科技有限责任公司进行DNA测序。

1.6 统计分析

根据PCR-SSCP检测结果,对多态基因座的不同基因型进行统计分析,利用MEGA 7.0软件比对核酸序列,POPGENE分析软件处理基因型频率等相关群体遗传参数,SPSS 20.0对生长性状指标参数进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 血液基因组DNA

提取待测定血液DNA浓度及纯度,得到单个样品质量浓度大于50 ng/μL,OD260/280为1.8～2.0,表明提取DNA样本纯度高,无污染;1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量,条带清晰、无杂带,表明提取DNA完整性高,符合后续试验标准。

2.2 DLK1基因PCR扩增产物

PCR扩增产物经过1%琼脂糖凝胶电泳检测如图1:各泳道电泳条带清楚,无杂带,符合其后SSCP电泳检测标准。

1—9.PCR扩增产物,250 bp;M.DL1000 Marker。

2.3 DLK1基因SSCP检测

PCR扩增产物用12%非变性聚丙烯酰胺凝胶,在恒温4 ℃,恒压180 V电压下进行SSCP电泳检测,结果如图2:DLK1基因共存在3种基因型,将其定义为AA、AB和BB。

图2 DLK1基因内含子5分型图

2.4 DLK1基因多态基因型测序

5个绵羊种群DLK1基因不同基因型PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测后纯化回收,送至生物公司进行测序。测序结果如图3。将标准序列XM_027957404.2与扩增序列进行比对(图4)发现,在DLK1基因内含子5区域发现突变位点G30412C(G→C)。

图3 测序峰图

图4 PCR扩增产物与GenBank同源序列的比对

2.5 DLK1基因多态位点遗传特性分析

结合SSCP及测序结果分析,统计出5个绵羊品种突变位点的基因型数量、计算基因型频率和等位基因频率,结果见表2。甘肃高山细毛羊、藏绵羊、蒙古羊、滩羊和小尾寒羊AB基因型及B等位基因频率分别为0.460 0/0.531 4、0.480 0/0.594 4、0.420 0/0.587 4、0.400 0/0.616 5和0.440 0/0.601 5。在5个绵羊品种中,AB基因型均为优势等位基因型,B均为优势等位基因,且在5个绵羊群体中均可以检测到这3种基因型的个体。

表2 绵羊DLK1基因遗传多态性分析

由表2可知,甘肃高山细毛羊、藏羊、蒙古羊、滩羊和小尾寒羊杂合度和多态信息含量分别为0.464 4/0.385 6,0.445 2/0.379 8,0.414 4/0.365 2,0.367 6/0.356 7和0.431 3/0.369 0,其中甘肃高山细毛羊杂合度最高,滩羊杂合度最低;甘肃高山细毛羊多态信息含量最高,滩羊多态信息含量最低,且5个绵羊品种均表现出中度多态性(0.25

2.6 基因多态性与生长性状关联分析

运用SPSS 20.0软件分析DLK1不同基因型与生长性能之间的相关性,结果如表3。基因型效应显著影响1月龄和3月龄绵羊的体长和胸围,对绵羊6月龄和9月龄体长、胸围的影响无统计学意义;1月龄和3月龄BB型绵羊个体体长和胸围显著高于AA型个体;总体来说,基因型效应对这5个绵羊品种的体长和胸围影响显著,对体高和体质量影响不大。

表3 绵羊DLK1基因不同基因型与生长性状的相关性分析

3 结论与讨论

DLK1首次被发现于神经母细胞瘤中,是人类目前已发现的印迹基因之一,其主要参与编码糖基化跨膜蛋白,同时还参与脂肪合成[14]。研究表明,DLK1基因在生物体生长发育和组织再生过程中发挥重要作用[15]。徐倩倩等[16]发现,当DLK1在骨骼肌中过表达时,小鼠骨骼肌表现出肥大性状,表明DLK1基因是否正常表达对肌肉组织发育和发挥功能起重要影响。与正常组织相比,DLK1在多种肿瘤组织中表达量有显著增高趋势,表明其对肿瘤的发生和发展起调控作用[17-18],同时DLK1可参与许多细胞的分化调节,其中包括脂肪细胞和血细胞生成调节,以及对创伤起修复作用。

作为一种印记基因,DLK1缺失或高表达都可能引起相关的印记基因疾病,但其致病的具体机制还未得到更加深入的研究[19]。目前,对于DLK1基因的多态性研究分析较多,涉及多个物种,但是在绵羊方面的研究非常少。本试验中DLK1基因并未检测到与Freking等[20]试验相一致的突变结果,可能是由于引种时发生了始祖效应或遗传漂变,以及受人工选择的影响。廖红海等[21]通过荧光定量PCR检测了山羊不同组织中DLK1基因的表达量,其结果显示,在山羊不同组织中DLK1基因均有表达,且肾脏组织中表达水平最高,脂肪组织中表达量最低,表明DLK1可能具有抑制脂肪合成的作用。陈付英[22]在南阳黄牛和郏县红牛遗传多态性与生长性状相关性研究中,对DLK1基因的多态性与生长发育性状进行相关性分析,发现不同的基因型对牛的生长发育有显著的影响。李云龙等[23]通过对宁夏滩羊、特克塞尔、萨福克这3个绵羊群体进行测序研究发现,其DNA序列共有5个突变位点,分别为第54 507位的G→C突变、第54 553位的T→C突变、第54 592位的 C→T 突变、第54 620 位的C→T突变和第54 638位的T→G 突变。通过与李云龙等[23]的研究序列比对发现,本研究在5个绵羊品种中,DLK1基因第5内含子的第30 412 bp处发现的G→C突变与其在第54 507处发现的G→C突变研究结果一致,且DLK1基因的不同基因型在滩羊的体高、体长和胸围这3个生产性状上存在显著差异与本次研究结果一致。陈付英等[24]对不同品种牛样本(秦川牛287头,南阳牛、郏县牛、晋阳牛、安格斯牛、中国荷斯坦牛、牦牛和水牛各50头)进行PCR-SSCP和DNA测序分析,结果表明,只在秦川牛DLK1外显子5位点检测到2个SSCP基因型,分别为E5-A和E5-B,且E5-A为优势基因型,通过测序结果分析发现此突变为同义突变,在其他样本中只检测到1种SSCP基因型。诸多研究证实,DLK1基因不同基因型和家畜的体长、胸围有显著相关性,这与本研究结果相同。因此,DLK1基因可以作为选择甘肃地方绵羊品种生产性状的候选标记基因。同时,通过对比分析5个不同品种绵羊的生产性能表明,小尾寒羊在不同月龄的生产性状均优于其他4个绵羊品种。

本研究通过对比5个不同品种绵羊的DLK1基因发现,DLK1基因在5个绵羊品种中均具有多态性,且在第5内含子区域内发现突变位点G30412C,其对于5个绵羊品种的体长和胸围具有显著相关性。以上结果表明,DLK1基因可作为选择甘肃地方绵羊品种生产性状的候选基因。