不同杂交类型甘蓝型油菜在重金属污染土中的适应性研究

彭多姿,黄颢源,范占煌,戴 悦,元妙新,张振乾

(1.湖南农业大学 农学院,湖南 长沙 410128;2.中节能大地(杭州)环境修复有限公司,浙江 杭州 310020)

土壤重金属污染问题日益严重,土壤中富集的重金属不仅会对植物的生长发育、产量、品质产生不利影响,还会严重影响其加工食品的质量和安全[1]。重金属污染土壤修复常用的方法有休耕、物理修复、化学改良修复和生物修复等[2]。生物修复操作简单、成本低、效果明显,且不会引起二次污染[3]。植物修复是生物修复的一种,具有应用性较好、清除重金属污染物较彻底、成本低廉、操作简单、安全清洁、环境友好等优点,是近年来研究的热点[4]。油菜(BrassicanapusL.)是中国南方地区第二大作物,不与水稻争地,种植技术简单,生物量远较蜈蚣草、野趾草等超富集修复植物大,且有较强的吸收累积镉能力[5],且重金属主要积蓄于粕饼中,毛油中重金属含量符合相关标准,不存在消费风险,可实现边修复边生产[6-7]。杨洋等[8]研究发现,重金属在不同类型油菜间的吸收积累及转运情况差异显著,芥菜型油菜适合Cu、Pb 污染的土壤,而甘蓝型油菜对 Zn、Cd 的吸收积累效果最好,适合用来修复重金属复合污染的土壤。范占煌等[9]研究结果发现,甘蓝型油菜在高浓度镉存在的土壤中仍能生长、结实,且不影响菜籽油的食用价值,是一种理想的修复植物。当前的研究多为不同基因型,如甘蓝型油菜[10]、白菜型油菜[11]和芥菜型油菜[12-13]之间的差异和不同类型甘蓝型油菜不同品种[14-16]的修复效果研究及同一材料不同生育期及部位间重金属累积情况[17],其中甘蓝型油菜栽培面积较大[18],因而相关研究较多,但不同甘蓝型油菜杂交类型油菜对修复作用影响相关的研究较少。

为明晰不同杂交类型油菜在修复重金属污染土壤中的差异,本研究以自交系159-6、单交油菜沣油520和三交油菜159-6×沣油520 为材料,通过盆栽试验比较在不同材料不同重金属污染土配比环境下的苗期长势、生理特性差异以及光合作用相关基因(Bna0280620[19]、Bna049040[20]和BnaC08g46180D[21])和抗金属性相关基因(BnaA08g04000D[21]、BnaA09g24330D[22]、BnNRAMP[23]和BnPri-miR167a[23])的表达量差异,以期找出适宜的重金属污染土壤油菜类型,为后续的修复研究及新品种选育提供参考。

1 材料和方法

1.1 试验材料

沣油520(20A×C3R,国审油2009009)、自交系159-6和三交油菜159-6×沣油520均由湖南农业大学农学院提供。

1.2 试验设计

设计盆栽试验,用营养土和污染土混合,以Ⅰ(100%营养土)生长环境为对照组Ⅰ(CK),设置不同污染土配比的Ⅱ(25%污染土,75%营养土)、Ⅲ(50%污染土,50%营养土)、Ⅳ(75%污染土,25%营养土)3个污染土环境,肥水、光照等其余条件均保持一致。每个生长环境下,每个材料种4盆,每盆留苗10株。

营养土:由基质土、优质锯末、进口椰糠、蛭石、珍珠岩混合发酵而成,含氮15%,含磷15%,含钾15%。

重金属污染土:由中节能大地环保公司提供,采集自温州填埋场。主要成分:干物质78.4%,pH=7.67,有机质133 g/kg,水溶性总盐量3.63 g/kg,镉含量为1.5 mg/kg,铬含量为913 mg/kg、镍含量为165 mg/kg、铅含量449 mg/kg、砷和汞含量分别12.600,0.443 mg/kg,以农用地土壤污染国家控制标准(GB15618-2008)为依据,镉超标150.0%,铬超标265.2%,铅超标164.1%。

1.3 试验方法

1.3.1 样品制备 油菜生长14 d后取新鲜叶片,于-80 ℃冰箱保存,用于测定生理生化指标;取新鲜叶片提取RNA,反转成cDNA于-80 ℃冰箱保存备用。

1.3.2 干质量测定 将油菜植株测鲜质量后置于烘箱,105 ℃杀青30 min,80 ℃烘48 h至恒质量,并称质量。

1.3.3 生理生化指标测定 分别采用蒽酮法测定可溶性糖含量,考马斯亮蓝G-250染色法测定可溶性蛋白含量,95%乙醇浸提法测定叶绿素含量,氮蓝四唑法测定超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)活性,愈创木酚法测定过氧化物酶(Peroxidase,POD)活性、过氧化氢法测定过氧化氢酶(Catalase from micrococcus lysodeikticus,CAT)和丙二醛(Malonaldehyde,MDA)含量[24]。

1.3.4 RNA提取和反转录 用TransZol Up Plus RNA Kit 试剂盒提取RNA(全式金生物,北京),用2100生物分析仪检测RNA质量(Agilent,美国)。用Hieff®1stStrand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR(gDNA digester Plus)试剂盒(翌圣生物,上海)反转合成cDNA。

1.3.5 基因表达情况分析 用NCBI设计引物,由湖南擎科生物技术有限公司合成(表1),利用全式金荧光定量试剂盒(全式金生物,北京)进行定量PCR扩增反应。利用Hieff®qPCR SYBR®Green Maste Mix(High Rox Plus)试剂盒(翌圣生物,上海)进行荧光定量PCR,具体操作参照说明书。

表1 qRT-PCR基因引物序列

1.4 试验仪器

U8000紫外分光光度计(元析,上海),冷冻离心机(元析,上海),2100生物分析仪(Agilent,美国)),GelDoc2000凝胶成像仪(Bio-Rad,美国),CFX96荧光定量PCR仪(Bio-Rad,美国),PTC200 PCR仪(Bio-Rad,美国)。

1.5 数据处理

RT-qPCR采用2-ΔΔCt方法计算基因相对表达量,用SPSS 22.0处理数据,Excel 2019作图。

2 结果与分析

2.1 不同油菜干鲜质量的差异分析

不同污染土配比对油菜干鲜质量的影响如图1,不同污染土配比下,159-6×沣油520和159-6鲜质量均高于对照组Ⅰ,且随着污染土比例的增加,先升高后降低;沣油520鲜质量均低于对照组Ⅰ,呈持续下降的趋势;159-6×沣油520干质量均高于对照组Ⅰ,呈先升高后下降的趋势;沣油520干质量均低于对照组Ⅰ,趋势为先下降后升高再下降;159-6干质量先下降后升高再下降,在50%污染土配比下高于对照组Ⅰ。在含25%污染土配比环境中,159-6×沣油520的鲜质量显著高于159-6(P=0.036)。在50%和75%污染土配比环境中159-6×沣油520的干质量和鲜质量均显著高于沣油520和159-6(P<0.05)。

不同小写字母表示同一处理下不同材料间差异显著(P<0.05)。图2—7同。

2.2 生理指标分析

2.2.1 不同油菜可溶性糖含量的差异分析 不同污染土配比对油菜可溶性糖含量的影响如图2,发现不同污染土配比下,油菜可溶性糖含量变化均较小,3个材料可溶性糖含量均无显著差异,说明这3个材料的可溶性糖含量受到重金属污染土环境影响较小。

图2 不同污染土配比处理对油菜可溶性糖含量的影响

2.2.2 不同油菜可溶性蛋白含量的差异分析 不同污染土配比下油菜叶片中可溶性蛋白含量差异如图3,159-6×沣油520可溶性蛋白含量随着污染土比例的增加,先升高后降低,在含50%和75%污染土配比环境下低于对照组Ⅰ;沣油520可溶性蛋白含量先降低后升高再降低,在含有25%和75%污染土配比环境下低于对照组Ⅰ,159-6可溶性蛋白含量变化趋势和沣油520一致,在25%污染土配比环境下低于对照组Ⅰ。在含25%和75%污染土配比环境中,159-6×沣油520和沣油520可溶性蛋白含量均显著高于159-6。除在50%污染土配比环境下,沣油520可溶性蛋白含量最高,与159-6×沣油520和159-6有显著差异。

图3 不同污染土配比处理对油菜可溶性蛋白含量的影响

2.2.3 不同油菜叶绿素含量的差异分析 不同污染土配比对油菜叶绿素含量的影响如图4,随着污染土比例的增加,油菜叶绿素含量呈先升高后降低的趋势。100%营养土环境中,159-6×沣油520叶绿素含量最高,显著高于159-6。在25%污染土环境下,159-6叶绿素含量显著高于159-6×沣油520和沣油520;在50%和75%污染土配比环境中,159-6×沣油520叶绿素含量均显著高于沣油520和159-6。

图4 不同污染土配比处理对油菜叶绿素含量的影响

2.2.4 不同油菜抗氧化酶活性和MDA含量的差异分析 不同污染土配比下油菜叶片中SOD、POD、CAT活性和MDA含量(以解质量外)差异如图5,SOD和CAT活性均随着污染土比例增加先升高后降低,且在含75%污染土配比环境下均低于对照组Ⅰ;POD活性和MDA含量随着污染土比例增加而逐渐升高。在含50%和75%污染土配比环境下,159-6×沣油520的SOD活性均最高;除75%污染土配比环境下,159-6×沣油520的POD活性均最高,其余污染土环境下沣油520的POD活性最高;不同污染土配比环境下,159-6×沣油520的MDA含量均最低。

图5 不同污染土配比处理对油菜SOD、POD、CAT活性和MDA含量的影响

2.3 相关基因表达情况分析

2.3.1 不同油菜光合作用相关基因表达量的差异分析 不同污染土配比下的油菜叶片中Bna0280620、Bna049040和BnaC08g46180D3个光合作用基因表达情况如图6,Bna0280620和Bna049040基因在不同污染土配比环境下的油菜叶片中均下调表达。在25%污染土环境下,BnaC08g46180D基因仅在沣油520叶片中上调表达;Bna0280620基因在159-6叶片中的表达量最高,在159-6×沣油520叶片中的表达量最低;Bna049040基因在159-6叶片中的表达量最高,在沣油520叶片中的表达量最低。在含50%污染土环境下,BnaC08g46180D基因仅在159-6×沣油520叶片中上调表达;Bna0280620基因在159-6叶片中的表达量最高,在159-6×沣油520叶片中的表达量最低;Bna049040基因在沣油520叶片中的表达量最高,在159-6叶片中的表达量最低。在含75%污染土环境下,BnaC08g46180D基因在3个材料中均上调表达,其中在沣油520叶片中的表达量最高,在159-6叶片中的表达量最低,Bna0280620和Bna049040基因在159-6×沣油520叶片中的表达量最高。

图6 不同污染土配比处理下光合作用相关基因在不同类型油菜叶片中表达情况

2.3.2 不同油菜抗重金属相关基因表达量的差异分析 不同污染土配比下的油菜叶片中4个抗重金属相关基因BnaA08g04000D、BnaA09g24330D、BnNRAMP1和BnPri-miR167a的表达情况如图7所示,BnaA08g04000D、BnaA09g24330D基因表达量随着污染土比例升高在3个材料叶片中先降低后升高;BnNRAMP1和BnPri-miR167a基因表达量均在75%污染土配比下的159-6×沣油520叶片中达最高值。在含25%污染土环境下,BnNRAMP1和BnPri-miR167a基因在159-6×沣油520和159-6叶片中表达量均显著高于沣油520。在含50%和75%污染土配比环境中,4个基因在159-6×沣油520叶片中的表达量均最高,在159-6叶片中的表达量最低,以上差异均达显著水平。

图7 不同污染土配比处理下抗重金属相关基因在不同类型油菜叶片中表达情况

2.4 基因表达与生理指标的相关性分析

2.4.1 污染土环境下油菜光合相关基因表达量与生理指标的相关性分析 对污染土环境下不同油菜叶片的基因表达量与生理指标进行相关性分析,结果如表2所示,基因表达量与可溶性蛋白和叶绿素的关系更密切。Bna0280620基因在159-6中的表达量与鲜质量、可溶性蛋白含量呈显著负相关,其中与可溶性蛋白含量的相关性最大;在159-6×沣油520中的表达量与可溶性蛋白含量呈显著正相关。Bna049040基因在159-6×沣油520中的表达量与可溶性糖呈显著正相关。BnaC08g46180D基因表达量与生理指标的关系较Bna0280620和Bna049040基因更密切,且在159-6中的相关性普遍低于沣油520和159-6×沣油520。BnaC08g46180D基因在159-6×沣油520中的表达量与鲜质量呈显著正相关、与干质量、叶绿素含量呈显著正相关,与可溶性蛋白含量呈显著负相关,其中与可溶性蛋白的相关性最大;在沣油520中的表达量与各个生理指标均呈负相关,其中与叶绿素的相关性最大;在159-6中的表达量与干质量呈显著负相关,与叶绿素呈显著负相关,其中与叶绿素的相关性最大。

表2 光合作用相关基因表达量与生理指标之间的相关性分析

2.4.2 污染土环境下油菜重金属胁迫相关基因表达量与酶活性的相关性分析 对污染土环境下不同油菜叶片的基因表达量与酶活性进行相关性分析,结果如表3所示。基因表达量与CAT和MDA的关系最密切,BnPri-miR167a基因在3个油菜中的表达量均与CAT和MDA有较高的相关性,其余基因在159-6×沣油520和159-6中的表达量也与CAT和MDA有较高的相关性。另外,各个基因的表达量与沣油520中的SOD关系最密切,其中BnNRAMP1基因的相关性最大;与沣油520×159中的POD关系最密切,其中BnPri-miR167a基因的相关性最高。

表3 重金属胁迫相关基因表达量与酶活性之间的相关性分析

3 结论与讨论

土壤中重金属元素在进入植物体后,极易在体内富集,会影响植物的各项生理指标,延缓植物生长,甚至会使植物死亡[25]。甘蓝型油菜较其余植物相比具有更高的生物量,更能耐受土壤中的重金属胁迫[26],但不同类型的油菜对重金属胁迫的适应能力不同[27-28]。本研究发现,3种甘蓝型油菜在不同配比重金属污染土环境下均能正常生长发育,表明油菜对重金属具有较强的耐性;其中,三交油菜159-6×沣油520的干鲜质量最高,且均显著高于对照组Ⅰ,说明其生长力更强,对重金属具有更高的耐性,适合种植在重金属污染的土壤中。

叶绿素含量的高低可反映出光合能力的强弱,叶绿素含量的增加,可以明显提高植物的光合能力[29]。而过量的重金属离子会影响叶绿素的合成和光合相关基因的表达水平,抑制植物的光合作用,破坏生理过程,阻碍植物的生长和发育[30-32]。本研究发现Bna0280620和Bna049040基因在不同污染土配比环境下的油菜叶片中的表达量均受到抑制,而在高浓度的重金属污染土环境下,诱导了BnaC08g46180D基因的表达。此外,通过相关分析发现光合相关基因表达量与可溶性蛋白和叶绿素含量有较高相关性,在含50%和75%污染土环境下,159-6×沣油520的叶绿素含量最高,在含50%污染土环境下,BnaC08g46180D基因在159-6×沣油520叶片中的表达量最高,在含75%污染土环境下,Bna0280620和Bna049040基因在159-6×沣油520叶片中的表达量最高。结果表明,在含50%和75%污染土环境下,159-6×沣油520的光合能力更强,有助于积累更多的干物质,从而提高对重金属的耐受性。

植物在重金属胁迫下会产生大量的活性氧(Reactive oxygen species,ROS),为了免受ROS的侵害,油菜会采取防御机制,产生大量的SOD、POD和CAT,来帮助清除活性氧物质,减少重金属对机体的损伤,提高对重金属的适应能力[33]。张敏[34]发现,在Cd胁迫下CAT和SOD活性均随胁迫浓度增加呈先增后降趋势,本研究结果与其一致,且在50%和75%污染土配比环境下,159-6×沣油520的SOD活性最高。MDA含量是评估抗氧化剂对重金属胁迫的破坏程度的重要指标,重金属胁迫下,当油菜膜脂过氧化产生的MDA含量逐渐增多,说明膜脂过氧化作用逐渐增强,膜受害程度逐渐加重,给油菜组织细胞带来极大的损伤[35]。本研究中MDA含量随着重金属污染土比例的增加而升高,说明重金属使油菜机体受到了损伤,但是159-6×沣油520的MDA含量最低,说明受到的损伤更小。此外,通过相关性分析发现。抗重金属相关基因表达量与抗氧化酶活性和MDA具有较高的相关性,且在50%和75%污染土配比环境下,4个抗重金属基因在159-6×沣油520叶片中的表达量最高,说明159-6×沣油520对重金属的适应能力更强。

以上结果表明,3种不同杂交类型的油菜在重金属污染土环境下均能正常生长,且具有一定的适应能力,其中,159-6×沣油520在重金属土壤中的抗逆能力最强,可能更适合作为土壤修复植物。

在不同污染土配比环境下,159-6×沣油520鲜质量和干质量均高于对照组Ⅰ,159-6鲜质量均高于对照组Ⅰ,沣油520鲜质量和干质量均低于对照组Ⅰ;且159-6×沣油520鲜质量和干质量均显著高于159-6和沣油520。除含25%污染土环境下159-6叶绿素含量最高外,其余159-6×沣油520的叶绿素含量均最高。除含50%污染土环境下沣油520可溶性蛋白含量最高外,其余159-6×沣油520的可溶性蛋白含量均最高。在50%和75%污染土环境下,159-6×沣油520的SOD活性均最高,MDA含量均低于159-6和沣油520;4个抗重金属相关基因(BnaA08g04000D、BnaA09g24330D、BnNRAMP1和BnPri-miR167a)在159-6×沣油520叶片中的表达量均高于159-6和沣油520;在75%污染土环境下Bna0280620和Bna049040基因在159-6×沣油520叶片中的表达量也高于159-6和沣油520。