温阳化浊退黄方治疗慢加急性肝衰竭的作用机制：基于UHPLC-QTOF-MS和网络药理学方法＊

王秀峰，张荣臻，陈月桥，王明刚，吕 超

（广西中医药大学第一附属医院 南宁 530023）

慢加急性肝衰竭（Acute-on-chronic liver failure，ACLF）是指慢性肝病患者受到多种急性损伤因素的影响，导致慢性肝病迅速恶化而产生的肝衰竭综合征[1-2]。ACLF 具有发病急和死亡率高等的特点，主要病因为乙型肝炎病毒感染，临床表现为极度乏力、凝血功能障碍、消化道症状等[3-5]。目前，临床治疗ACLF的方法主要有内科综合治疗、人工肝、肝移植、保肝和营养支持等，其中肝移植是目前唯一有效的方法，但其价格昂贵、肝资源稀缺，所以发展受限[6-8]。

诸多研究表明中医药在治疗ACLF 上具有显著的疗效[9-10]。温阳化浊退黄方是在解毒化瘀颗粒的基础上变裁而来的有效复方，该方由白附片、干姜、白术、茵陈、生大黄、赤芍、虎杖、人参、甘草组成，长期临床实践表明该方对促进黄疸消退和降低肝衰竭病死率等方面具有良好的临床疗效。本课题组在之前的研究中发现温阳化浊退黄汤能够改善患者的肝功能，对治疗ACLF 具有较好的治疗效果。此外在常规西医治疗基础上使用温阳化浊退黄汤能够改善ACLF 患者的炎症反应和凝血功能[11-12]，但关于温阳化浊退黄方治疗ACLF 的作用机制还不明确。因此，本研究利用UHPLC-QTOF-MS 方法对温阳化浊退黄方的成分进行分析，并运用网络药理学和动物模型实验验证明确温阳化浊退黄方治疗ACLF 的作用机制，为进一步探索ACLF的发病机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康的SPF 级Wistar 雄性大鼠90 只，体质量250±30 g，购于北京斯贝福生物技术有限公司，实验动物使用许可证号：SYXK（鄂）2018-0104，动物合格证号：110324210100359872，伦理审批批准号：HLK-20191106-001。

1.2 主要试剂与仪器

温阳化浊退黄[白附片（先煎）30 g、干姜15 g、茵陈30 g、生大黄6 g、赤芍30 g、虎杖15 g、人参15 g、白术15 g、甘草10 g，使用中药饮片，由广西中医药大学第一附属医院实验室中心煎制，含生药量为4.34 g·mL-1]，甲醇（CNW Technologies，LC-MS 级，67-56-1），甲酸（CNW Technologies，LC-MS 级，64-18-6），乙腈（CNW Technologies，LC-MS 级，75-05-8），L-2-氯苯丙氨酸（上海恒柏生物科技有限公司，≥98%，103616-89-3），二甲苯、无水乙醇、30% H2O（2均来自国药集团化学试剂有限公司，货号分别为：10023418、10009218、10011218），DAB 浓缩型试剂盒、中性树脂、封闭山羊血清、伊红（均来自中国Solarbio 公司，货号分别为DA1010-2*3 mL、G8590、SL038-10 mL、E8090），苏木素、20×Tris-EDTA 修复液pH=9.0（均来自中国Servicebio公司，货号分别为G1004、G1203）。

超高效液相（日本岛津公司，型号：Nexera UHPLC LC-30A）；高分辨质谱（美国AB Sciex 公司，型号：Triple TOF 5600）；色谱柱（美国Waters 公司，型号：ACQUITY UPLC BEH C181.7 µm 2.1×100 mm）；正置显微镜、石蜡切片机（均来自德国徕卡显微系统有限公司，型号分别为DM1000、RM2235）；生物组织包埋机、生物组织包埋机-冷冻机（均来自湖北泰维科技实业股份有限公司，型号分别为TB-718D、TB-718L）。

1.3 UHPLC-QTOF-MS检测温阳化浊退黄方活性成分

1.3.1 代谢物提取

取300 µL 药方样本，加入甲醇和水的体积比为4∶1、IS=1000∶10 的提取液1000 µL，涡旋30 s，冰水浴超声处理5 min；-20℃条件下静置1 h；4℃，12000 rpm离心15 min；取出上清过0.22 µm 微孔滤膜于进样瓶中。

1.3.2 UHPLC-QTOF-MS条件

色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18（2.1×100 mm，1.7 µm）；流动相：0.1%甲酸水溶液（A），乙腈（B），梯度洗脱：0-3.5 min，95%-85% A；3.5-6 min，85%-70% A；6-6.5 min，70% A；6.5-12 min，70%-30% A；12-12.5 min，30% A；12.5-18 min，30%-0%A；18-25 min，0% A；25-26 min，0%-95% A；26-30 min，95% A；流速：400 µL·min-1；进样体积：5 µL。

AB 5600 Triple TOF 质谱仪能够在控制软件（Analyst TF 1.7, AB Sciex）控制下进行一级、二级质谱数据采集。筛选出每个数据采集循环中强度最强且大于100 eV 的离子，并采集对应的二级质谱数据。轰击能量：40 eV，碰撞能差：20V，15 张二级谱图每50 ms。ESI 离子源参数设置如下：雾化气压（GS1）：55 psi，辅助气压：55 psi，气帘气压：35 psi，温度：550℃，喷雾电压：5500 V（正离子模式）或-4000V（负离子模式）。

1.3.3 温阳化浊退黄方成分鉴定

将质谱原始数据导入Progenesis QI 软件，进行如下工作：保留时间矫正、峰识别、峰提取、峰积分、峰对齐等，创建复方中相应中药代谢库，利用自建二级质谱数据库和相应裂解规律匹配法对含有MS/MS 数据的峰进行物质鉴定。

1.4 网络药理学方法

1.4.1 TCMSP 数据库筛选温阳化浊退黄方活性成分靶点

利用TCMSP（http://tcmspw.com/tcmsp.php）进行数据挖掘，将人体口服生物利用度（OB）≥30%且药物相似性（DL）≥0.18设置为TCMSP中药有效成分的筛选参数，筛选活性成分；在TCMSP 数据库检索活性成分对应的靶点，通过UniProt 数据库（http://www.uniprot.org）将靶点名称转换为基因简称；PubChem 数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）检索复方活性成分的分子化学结构信息，通过Swiss target Prediction数据库（http://www.swisstargetprediction.ch/）进行化合物靶点筛选。取TCMSP 和Swiss target Prediction 数据库筛选靶点交集，记为温阳化浊退黄方活性成分对应靶点。

1.4.2 温阳化浊退黄方靶蛋白PPI分析

使用STRING 网站（https://cn.string-db.org/）分析靶点之间蛋白互作关系，获得温阳化浊退黄方的核心靶点。

1.4.3 慢加急性肝衰竭靶基因筛选

在OMIM（http://www.omim.org/）、DisGeNET（https://www.disgenet.org/）和GeneCard（https://www.genecards.org/）3 个数据库中输入“acute-on-chronic liver failure”选取相关性≥60%作为慢加急性肝衰竭相关靶点，将3个数据库中的相关靶点取并集作为ACLF预测靶点。

1.4.4 温阳化浊退黄方与慢加急性肝衰竭共有靶点分析

温阳化浊退黄方活性成分预测靶点与慢加急性肝衰竭预测靶点取交集，绘制韦恩图。采用DAVID 分析工具对获得的靶蛋白进行基因本体（GO）分析，GO数据包括生物学过程（BP）、细胞定位（CC）和分子功能（BP）三大类；然后进行京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集通路分析，物种设置为人（Homo sapiens），以P＜0.05 为标准确定功能及重要通路，并对通路进行注释和分析。

1.4.5 靶点-通路网络分析

基于共有靶点-通路关系，将得到的前10 条KEGG 富集通路与相关靶点利用Cytoscape 构建药理学网络图。

1.5 动物模型实验验证

1.5.1 建立大鼠慢加急性肝衰竭实验模型

大鼠尾静脉注射20%的人血清白蛋白15 mg·kg-1，每周2次，6周后成模。在肝硬化基础上采用腹腔注射脂多糖（100 µg·kg-1）和D-氨基半乳糖胺（400 mg·kg-1）构建ACLF大鼠模型[13]。

1.5.2 模型鉴定

HE 染色鉴定ACLF 模型构建是否成功。药物干预完成后，处死大鼠，取肝组织用4%多聚甲醛固定24 h 以上，分别用70%、80%、90%、95%无水乙醇梯度洗脱30 min，无水乙醇脱水2 次，二甲苯透明，石蜡包埋，切成厚度为5 µm的组织切片。染色后观察肝组织病理改变，特别是肝细胞损伤，并在光镜下拍照，鉴定ACLF模型构建是否成功。

设计意图：以问题为载体，引导学生思考，帮助学生理清思路，学会科学探究。同时生活化的问题可以使学生认识到学习化学可以服务于生活，与生活的联系之紧密，学以致用，提升学生学习化学的热情，让学生充分体验思考的快乐。

1.5.3 分组及处理

运用随机数字表法将90 只大鼠分为6 组，每组15 只，分别为空白组、模型对照组，胸腺五肽组（0.11 mg·kg-1）、温阳化浊退黄方低剂量组（0.23 g·kg-1）、温阳化浊退黄方中剂量组（0.46 g·kg-1）、温阳化浊退黄高剂量组（0.92 g·kg-1）。由于动物模型存在时效性，中药组及胸腺五肽组于造模前5天开始灌胃给药，根据人用剂量换算大鼠灌胃液体量为每天2 mL·100 g-1体质量，正常组与模型对照组给予等量蒸馏水，一直持续至成模后48 h，每天2次，间隔12 h。结束后戊巴比妥钠过量麻醉小鼠致死，取肝脏组织并用多聚甲醛进行固定。

1.5.4 HE染色观察肝脏组织病理学损伤

按照1.5.2 中的方法观察各组大鼠肝脏组织的损伤情况，并拍照。根据文献中的方法进行病理评分：从胞体固缩、胞质染色消失、空泡变性、胞核消失、红细胞淤积、炎性细胞浸润6个方面进行评分，视野内未见病变记0 分，病变占视野＜10%记1 分、10%-50%记2 分、50%-100%记3分，6个方面评分总和即为病理评分[14]。

1.5.5 免疫组织化学染色分析肝脏组织中AKT1、MTOR和RAF1的表达

每组选择3个样本检测。将固定好的大鼠肝脏组织脱水浸蜡包埋，制作切片（厚度约为3 µm），烤片脱蜡水化，采用1 mmol·L-1Tris-EDTA 缓冲溶液中高压（125℃·103 KPa）修复18 min，自然冷却后，PBS 溶液洗3 min×3次，3% H2O2孵育10 min，PBS冲洗3次；10%山羊血清孵育30 min，PBS 冲洗3 次。加入一抗稀释液（AKT1 为1∶100，MTOR 为1∶150，RAF1 为1∶100），4°C 孵育过夜，PBS 冲洗3次；加入二抗稀释液，室温孵育30 min，PBS 冲洗3 次；DAB 染色，有颜色变化时洗去染色液。苏木素复染3 min，1%盐酸酒精分化，流水冲洗后乙醇脱水，二甲苯透明2 次，中性树脂封片，显微镜下选取5 个视野，拍照。利用Image Pro Plus 软件进行半定量分析，测量面积（Area）和累计光密度（IOD），计算平均光密度（MOD）MOD=IOD/Area。

1.6 统计学方法

用GraphPad Priam 8.0 进行统计学分析并作统计图，数据符合正态分布用平均值±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD 检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 温阳化浊退黄方活性成分及靶点预测

表2 根据ADME筛选的活性成分

2.2 温阳化浊退黄方靶蛋白PPI分析

图1为温阳化浊退黄方活性成分预测靶点对应的蛋白互作网络图，包含181 个节点，1618 条边，节点大小表示Degree 值的大小。其中综合数值评分为0.999的相互蛋白为AKT1-NOS3、AKT1-GSK3B、AKT1-MTOR、AR-NCOA2、AURKA-CDK1、CCNA2-CDK2、CCNA2-CDK1、FLT1-VEGFA、FNTA-FNTB、IGF1RPTPN1，这些蛋白间的相互作用具有重要地位。Degree 值排名前5 的分别为AKT1、VEGFA、TNF、CASP3、EGFR，Degree值分别为85、75、74、70、67。

图1 温阳化浊退黄方活性成分预测靶点PPI蛋白互作图

2.3 温阳化浊退黄方与慢加急性肝衰竭共有靶点筛选

在3个数据库中查找疾病相关靶点，取并集，得到慢加急性肝衰竭靶点2019个（图2A）。将2019个慢加急性肝衰预测靶点与181个温阳化浊退黄方活性成分预测靶点取交集，绘制韦恩图，得到慢加急性肝衰和温阳化浊退黄方共有靶点99个（图2B）。

图2 预测靶点维恩图

2.4 温阳化浊退黄方与慢加急性肝衰竭共有靶点的GO和KEGG通路富集分析

在BP 中靶点共涉及1722 个生物过程，主要为细胞粘附的调节，外部凋亡信号通路等（图3A）；在CC中靶点共涉及61 个细胞定位，主要为膜筏、膜微域、囊腔、胞质囊腔和细胞的顶端部分等（图3B）；在MF中靶点共涉及139 个分子功能，主要为蛋白质酪氨酸激酶活性、血红素结合和四吡咯绑定等（图3C）。KEGG 通路分析结果显示，共富集到147条信号通路，温阳化浊退黄方治疗慢加急性肝衰竭主要涉及PI3K/Akt 信号通路、VEGF 信号通路、乙型肝炎、凋亡通路、MAPK 信号通路、Toll样受体信号通路等（图3D）。

2.5 活性成分-靶点-通路的网络分析

构建活性成分-靶点-通路网络图（图4）。Degree排名前4 的靶点AKT1、PI3KR1、RAF1、TNF 作为温阳化浊退黄方治疗ACLF 的关键作用靶点。该网络图直观的体现温阳化浊退黄方通过多成分、多靶点和多通路治疗慢加急性肝衰竭的作用机制。

图4 温阳化浊退黄方与慢加急性肝衰竭活性成分-靶点-KEGG通路网络图

2.6 模型鉴定

与空白组比较，模型组肝细胞膨大，出现空泡化，肝窦扩张，小面积充血，血管、胆管外有炎性细胞浸润，表明ACLF模型构建成功（图5）。

2.7 各组大鼠肝组织病理变化结果

与空白组相比，模型对照组肝细胞出现空泡化，肝窦扩张充血，血管和胆管外有大量炎症细胞浸润；胸腺五肽和不同剂量的温阳化浊退黄方干预后充血程度和炎性细胞浸润程度较模型对照组均明显降低。病理评分结果显示，与空白组相比，模型对照组病理评分显著升高（P＜0.01）；与模型对照组相比，胸腺五肽组和温阳化浊退黄方中、高剂量组病理评分显著降低（P＜0.01）（图6）。

图6 各组大鼠肝组织病理形态改变（HE, ×200）

2.8 各组大鼠肝脏组织AKT1、MTOR 和RAF1 蛋白的表达

与空白组相比，模型对照组大鼠肝脏组织中AKT1、MTOR 和RAF1 蛋白的阳性表达显著增多（P＜0.01）；与模型对照组相比，胸腺五肽组和温阳化浊退黄方低、中、高剂量组大鼠肝脏组织中AKT1、MTOR和RAF1蛋白的阳性表达显著减少（P＜0.01）（图7）。

图7 各组大鼠肝脏组织中AKT1、MTOR和RAF1表达情况（n=3）

3 讨论

网络药理学以系统生物学和多向药理学为理论基础，通过阐述“疾病-基因-靶标-药物”间复杂的网络关系，进行药物作用研究，阐明药物与机体的功能关系。这与中医整体观、辨证论治等的原则和中药及其方剂多成分、多途径、多靶点协同作用的原理相一致。网络药理学强调对信号通路的多途径调节，具有可靠性和真实性等优点，在中医药现代化的研究中得到广泛应用[15-17]。中医认为“正虚邪实”是ACLF 发生和发展的主要病机，ACLF 患者多表现为黄疸、恶心、呕吐、高热和神昏嗜睡等。温阳化浊退黄方具有温阳化瘀、解毒退黄的功效，在临床治疗ACLF 中取得了较好的疗效，但其机制仍不明确。

本研究采用UHPLC-QTOF-MS 技术从温阳化浊退黄方中鉴定了123 个化学成分，通过网络药理学筛选出12 个活性成分，包括黄酮类、异黄酮类、单萜类、醌类和咖啡酰奎宁酸类等，其中黄酮类成分居多。研究表明，黄酮类化合物在治疗ACLF 中具有显著作用。通过数据库筛选化合物靶点，得到181个对应靶点，其中关键核心靶点为AKT1、CASP3 和EGFR 等。AKT1参与多种生物学过程，包括生长、增殖、存活和凋亡等，AKT 的激活依赖PI3K 途径，Jin 等[18]对ACLF 进行功能分析，结果同样显示AKT1 为有差异的修饰基因。CASP3 在调控细胞凋亡的过程中具有至关重要的作用，能够诱导肝细胞的凋亡，毛德文等[19]发现CASP3参与急性肝衰竭疾病的发展进程，CASP3 表达下调能够抑制肝细胞凋亡。EGFR 是表皮生长因子受体家族成员EGFR 信号通路对细胞的生长、增殖和分化等过程具有重要的作用，孙凤丹等[20]发现EGFR 蛋白的高表达与乙型肝炎病毒感染有关，证明EGFR与ACLF密切相关。综上，这些靶点是温阳化浊退黄方的核心靶点，均与肝衰竭有着密切的联系，表明温阳化浊退黄方是通过多成分、多靶点来治疗ACLF的。

本研究KEGG 通路分析结果显示，温阳化浊退黄方通过多条信号通路治疗慢加急性肝衰竭，包括PI3K/Akt 信号通路、VEGF 信号通路、乙型肝炎、凋亡通路、MAPK 信号通路等。PI3K/Akt 信号通路相关蛋白在调节细胞凋亡和炎症的过程中有着关键的作用，该通路中涉及到20 个关键靶点（JAK2、VEGFA、NOS3、AKT1、FASLG、EGFR、IL2、RAF1、MTOR、IGF1R、BCL2、FLT1、FGF2、PIK3R1、PRKCA、GSK3B、FLT3、PIK3CG、BCL2L1、MCL1），这些靶蛋白主要参与炎症、凋亡和代谢等。研究显示PI3K/Akt 信号通路的激活可有效减轻肝功能损伤，减轻机体的氧化应激状态，抑制肝细胞的凋亡，最终达到保护肝脏的目的[21-22]。研究表明多种中药活性成分能够通过PI3K/Akt 信号通路缓解ACLF 小鼠的肝功能损伤[23-24]，证实PI3K/Akt 信号通路在缓解肝损伤中的重要作用。王圣鑫等[25]发现本研究筛选出的白附片中的活性成分能够通过调控PI3K/Akt 信号通路保护细胞的氧化应激损伤，证实了白附片在复方中的君药地位。此外，VEGF 水平被认为能够反映肝功能损伤的程度，而MAPK参与肝脏损伤、应激和凋亡的调节。综上，表明温阳化浊退黄方可通过这些通路靶向调控ACLF，对研究其深层机制具有重要意义。

活性成分-靶点-通路网络分析结果显示活性成分与各关键靶点AKT1、RAF1、TNF 等均具有关联，而这些关键靶点参与多条温阳化浊退黄方治疗ACLF 的信号通路，表明温阳化浊退黄方是通过多成分、多靶点、多途径来实现治疗ACLF 的。最后本研究利用动物实验进行验证，结果显示温阳化浊退黄方能够有效减轻ACLF 大鼠模型的肝损伤，且本课题组前期研究也发现温阳化浊退黄方能够显著降低ACLF 模型大鼠血清中谷丙转氨酶、谷草转氨酶和胆碱酯酶的水平[26]，证明了温阳化浊退黄方在治疗ACLF 中的作用。最后，本研究选择了AKT1、MTOR 和RAF1 进行验证，这3 个靶蛋白均参与细胞凋亡、增殖和炎症等的调控，且均参与PI3K/Akt 信号通路，结果显示温阳化浊退黄方能够显著降低这些关键蛋白在ACLF 模型大鼠肝组织中的表达，与预期结果相符合，证实了温阳化浊退黄方是通过作用于关键通路中的关键靶点发挥治疗ACLF的作用。

综上所述，本研究采用UHPLC-QTOF-MS 联合网络药理学和实验验证的方法对温阳化浊退黄方治疗ACLF 的作用机制进行了研究，证实了温阳化浊退黄方通过多成分调控重要靶点和通路发挥治疗慢加急性肝衰竭的作用。