夹脊电针对脊髓损伤大鼠脊髓病理形态及死亡受体6表达的影响＊

梁雪松，阎路达，王舢泽，张 瑜，周 鹏，符文彬＊＊

（1. 广州中医药大学第二附属医院 广州 510120；2. 深圳市宝安区中医院 深圳 518100）

脊髓损伤（Spinal cord injury，SCI）是一种永久性的损伤，往往导致损伤节段以下的肢体瘫痪、大小便失禁及性功能障碍，给社会、家庭、个人带来巨大负担[1]。目前切实有效的靶向治疗方法仍然难以找到。研究表明，夹脊电针能显著改善SCI 大鼠肢体运动功能[2]，但作用机制仍待阐明，SCI 后脊髓微环境中发生一系列病理性改变，包括组织水肿缺血、兴奋性氨基酸毒性、炎症反应、神经细胞凋亡、轴突再生障碍等机制。其中轴突髓鞘再生障碍是阻碍脊髓神经细胞修复的重要因素，死亡受体6（DR6）是调控髓鞘再生神经细胞-少突胶质细胞（Oligodendrocytes，OL）的负性调控因子，抑制DR6 的功能会促进少突胶质细胞成熟分化、髓鞘形成及再生。DR6 缺失的小鼠在两种脱髓鞘模型中均表现出增强的再髓鞘形成[3]。本研究通过检测SCI 后大鼠行为学、脊髓组织形态学、微环境中DR6 蛋白及mRNA 表达及少突胶质细胞标志蛋白CNpase 蛋白变化，探讨夹脊电针改善脊髓损伤的潜在作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

健康清洁级成年SD 雌性大鼠24 只，体质量200-250 g，由辽宁长生生物技术有限公司，[SCXK（辽）2015-001]，在广州中医药大学第七临床医学院中心实验室动物房（清洁级）适应性喂养1周，12 h白12 h黑，温度22±1 ℃，湿度45%-55%，自由进食饮水。整个动物实验的过程中对实验动物进行的所有各种处理程序均遵照国家标准中华人民共和国科技部2006 年最新颁布的有关动物的使用说明及伦理学规定（动物伦理批件号：KY-2019-002-01）。

采用随机数字表将动物随机分为4 组，分别为假手术组、假手术+电针组、模型组、模型+电针组，每组6只。

1.2 主要仪器与试剂

石蜡切片机（RM2235，德国Leica公司），电热恒温鼓风干燥箱（QH01-9030A，上海精宏公司），超纯水系统（NW10LVF，香港Heal Force 公司），显微镜（BX53，日本OLUMPUS 公司），电泳仪（DYY-7C，北京六一公司），超速冷冻离心机（H-2050R，湖南湘仪公司），酶标仪（ELX-800，美国BIOTEK 公司），华佗牌针灸针，电热恒温培养箱（DH36001B，天津泰斯特公司），微量移液器（Proline，苏州BIOHIT 公司），紫外分光光度计（NANO 2000，美国Thermo 公司），荧光定量PCR 仪（Exicycler 96，韩国BIONEER 公司）TRIpure（RP1001北京BioTeke 公司），BeyoRT II M-MLV 反转录酶（D7160L，上海碧云天生物技术公司），RNase inhibitor（RP5602，北京BioTeke 公司），苏木精（H8070，中国Solarbio 公司），全蛋白提取试剂盒（WLA019，中国wanleibio 公司），SDS-PAGE 凝胶快速制备试剂盒（WLA013，中 国 wanleibio 公 司） ，PVDF 膜（IPVH00010，美国Millipore 公司），DR6（A7365，中国ABclonal公司）。

1.3 大鼠SCI模型建立

大鼠称重后，按照3.5 mL·kg-1给予一定量的10%水合氯醛腹腔麻醉，麻醉生效后，大鼠俯卧位固定，常规消毒铺巾，从上腹下位T13 肋骨下切口定位，确定T10 棘突的相对位置，术野备皮，碘伏酒精常规消毒，切开两侧皮肤间距至少在1.0 cm，分开切口两侧的皮下筋膜，沿椎棘突边缘切口用止血钳钝性的结扎和分离椎棘突旁部的松弛肌肉，暴露棘突，眼科剪离法轻轻剪切割去椎间棘突的上侧棘韧带及椎上下棘突间段的棘韧带，充分地剥离并显露T9-T11 棘突；以血管钳轻轻地夹住显露的T9 棘突，轻轻地提起，咬去T10 棘突，暴露T10 椎板，轻柔地把T9-T10 椎板之间黄韧带移去，精细地用咬骨钳咬去T10 椎板，暴露硬脊膜。充分止血、夹钳支持固定住脊髓动脉瘤钳夹，将张开瘤钳夹紧后从脊髓第T10 节段的起始处垂直横跨于脊膜，置入瘤夹（标定力量为70 g）钳，垂直完全横跨至脊髓，松开夹钳后可使脊髓瘤钳夹钳完全释放，紧紧垂直完全夹住到脊髓，计时，持续约60 s，取出瘤夹。小方块明胶海绵覆盖脊膜，创面应用青霉素液，分层缝合，术毕。皮肤再次严格消毒，不包扎切口。腹腔注射生理盐水20 mL，补充水电解质。假手术组仅打开椎板，不夹脊髓，其他干预措施也同模型组。术后，大鼠单笼饲养，皮下注射青霉素针量约10 万单位，1 次/天，持续1 周。每日早晚定时进行膀胱内挤压式排尿两次，给予截瘫护理。观察皮肤有无压疮或感染，下肢有无溃烂。待大鼠苏醒后BBB 评分为1-3 分及下腹部触诊膀胱胀大确认造模成功[4]。

1.4 干预方法

假手术组：仅打开椎板，开椎板，不夹脊髓，同其他各组大鼠一同捆绑，常规饲养，不予任何处置。

假手术+电针组：仅打开椎板，开椎板，不夹脊髓，同其他各组大鼠一同捆绑，常规饲养，3 h 后给予夹脊电针干预[5]：选取0.35 mm×13 mm 华佗牌针灸针，经常规穴位消毒后，直刺入T9、T11节段夹脊穴下4-5 mm，使针尖碰触椎板，并将电针仪正负极接头分别夹在同侧两针柄，正极在上、负极在下，调节计时器至30 min，调节电流输出在1-2 mA，输出频率为100 Hz，见大鼠背部肌肉微弱抽动未见剧烈挣扎表现为度，每天治疗1次，1次30 min，连续治疗7天[6]。

模型组：按照手术操作进行造模，同其他各组大鼠一同捆绑，常规饲养。

模型组+电针组：按照手术操作进行造模，同其他各组大鼠一同捆绑，常规饲养，3 h 后给予夹脊电针干预。

1.5 观察指标与检测方法

一般状况：观察并记录各组大鼠的精神状态、体质量变化、肢体活动、外观体征（毛发光泽及脱落情况）、排便情况等，观察大鼠有无发生死亡。

BBB 评分：各组大鼠均于模型建立后第7 天运用BBB 运动功能评分量表进行行为学评定，BBB 评分量表是评价脊髓损伤大鼠肢体功能变化最客观、应用最广的量表之一，能较细微的评定有效运动能力的变化[7-8]，评分由0-21 分，0 分代表后肢完全无活动，21 分代表后肢体功能正常，评分越低提示后肢运动障碍越严重，内容包含了运动情况、躯干稳定性、步态、协调性及爪精细动作等。观察室将大鼠置于宽大的场地，让其自由活动，采用双人双盲法观察后肢运动功能，评定至少4 min，取两位评估者平均值作为每只大鼠的BBB评分。

肉眼观察脊髓形态、HE 染色观察各组大鼠脊髓组织病理变化：BBB 评分后，通过断头处死，打开椎管肉眼观察脊髓形态是否正常、结构是否完整，并拍照，取损伤段4 cm 脊髓组织置于冰盒上并在4%多聚甲醛缓冲液中固定，4℃冰箱存放使用。将组织置于二甲苯中澄清，置于二甲苯+石蜡中透蜡，包埋成硬蜡块，切成5 µm 的片，置于培养箱中干燥。取出切片，在烘箱中烘烤30 min，而后分步置于二甲苯、二甲苯Ⅱ、无水乙醇、无水乙醇Ⅱ、95%，85%，75%乙醇及蒸馏水中，逐步脱蜡至水：分步置于苏木精中、蒸馏水、1%盐酸乙醇，浸泡、伊红染料溶液，反复浸泡并冲洗相应残留物染色。再逐步脱水、透明、封片，室温晾干，于200×镜下观察染色效果并拍照。

Western blot 检测各组大鼠脊髓组织中DR6 蛋白及少突胶质细胞标志蛋白CNpase的表达：将切好的脊髓组织加0.5 mL 裂解缓冲液，置于冰上静置5 min，低温冷冻离心机，12 000rpm，4℃，离心10 min，分离上清为所得的蛋白质抽提物。100℃水浴锅加热10 min，以充分变性蛋白。SDS-PAGE 蛋白电泳、转膜、漂洗，5%脱脂奶粉室温封闭2h，加入DR6抗体（DR6 antibody一抗稀释比例1∶1000）孵育，缓慢摇动4℃过夜，浸入TBST 中，摇床摇动5 min，共4 次。加入二抗（1∶5000），室温孵育2 h，将PVDF 膜放置于保鲜膜上，避光配置显色液并覆盖PVDF 膜，均匀地洒上ECL 发光液，静置反应5 min，转入暗盒中，在暗室空间里进行曝光，将目标胶片带进行扫描，用凝胶图象处理系统（Gel-Pro-Analyzer 软件）来进行图像分析并得到目标条带上的光密度值。

Real-time PCR 检测各组大鼠脊髓组织DR6 mRNA 表达：研磨脊髓组织，加入裂解液，采用总RNA试剂盒提取RNA。提取RNA 后，检测纯度，通过紫外分光光度法检测样本中RNA 的浓度。取1 µL RNA，进行反转录，以得到对应的cDNA。采用荧光定量试剂盒对DR6mRNA 相对表达水平进行定量检测，引物序列：DR6-F：5’-ACGCTCACAAGCATTTCG-3’；DR6-R：5’-GCCGTTGCGGTAGTAGATC-3’；β-actin-F：5’-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTAGC-3’；β-actin-R：5’-GGCCGGACTCATCGTACTCCTGCTT-3’，采用2-△△CT方法计算DR6 mRNA相对表达水平。

1.6 统计学分析

采用SPSS 20.0统计分析软件进行处理，计量资料数据以均值±标准差（）表示，采用单因素方差分析（One-way ANOVA）多组间均数比较；两两比较，若方差齐，采用LSD 法；方差不齐，则采用Dunnett's T3 法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠基本状况

各组大鼠无死亡，取材前各组大鼠情况如下：

Sham 组与Sham+EA 组：实验全过程中所有大鼠精神反应灵敏，活动灵活，毛色白有光泽，进食及排便未见异常，体质量略有增长。

Model 组：大鼠出现精神欠佳，下肢活动不能，上肢活动正常，皮毛微黄无光泽，无压疮或感染，下肢有无溃烂，进食量稍有减少，排便需人工促排，体质量略有减轻。

Model+EA 组：大鼠精神尚可，下肢活动逐渐恢复，上肢活动正常，皮毛微黄无光泽，无压疮或感染，下肢有无溃烂，进食量稍有减少，人工促排便次数减少，体质量略有减轻。

2.2 各组大鼠BBB评分比较

7 天治疗结束后，运用BBB 评分对大鼠后肢运动功能进行评分，Sham 组与Sham+EA 组均为满分21分，假手术操作及电针治疗并未对正常大鼠后肢运动功能产生影响；与Sham 组比较，Model 组大鼠BBB 评分显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。与Model 组大鼠比较，Model+EA 组大鼠BBB 评分升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。以上结果表明脊髓损伤后大鼠出现了严重的肢体运动功能障碍，夹脊电针能显著改善其运动功能（见图1）。

图1 各组大鼠BBB评分比较（，n=6）

2.3 脊髓形态及病理变化观察

肉眼观察脊髓形态显示：肉眼可见Sham 组与Sham+EA 组脊髓外形呈现白素色，未见淤血现象，组织结构完整。Model 组脊髓组织损伤段可见大面积淤血现象，组织结构破坏严重。Model+EA 组脊髓组织损伤段淤血面积及结构破坏程度明显轻于Model 组（见图2）。

图2 各组大鼠脊髓组织外观肉眼观测结果

HE 染色观察大鼠脊髓病理形态学结果显示：光镜下Sham 组与Sham+EA 组脊髓组织切片均可见各结构形态完整，排列紧密，灰白质分界清晰，未见明显出血，神经元无胞体肿胀、胞核位于胞体中央、大而圆，未见固缩，着色浅，核仁清晰可见。Model 组脊髓组织疏松严重，灰白质界限只能隐约可见，存在部分出血灶，大量炎症浸润，胶质细胞增生明显，灰质内有神经元残存，核浓缩，体积变小甚至消失，白质内可见大量的小脂滴形成大量的空泡细胞。Model+EA 组脊髓组织损伤较Model组轻，出血点面积减少，淋巴细胞浸润少于Model组，神经细胞出现修复现象，出现一定量髓鞘再生（见图3）。

图3 各组大鼠脊髓组织HE染色结果（200×）

2.4 脊髓组织DR6表达变化

Sham 组和Sham+EA 组大鼠脊髓组织中DR6 蛋白表达量维持在少量稳定的低水平，假手术操作及电针治疗并未对正常大鼠脊髓组织DR6 表达产生影响；Model 组大鼠脊髓组织DR6 蛋白表达显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05），表明模型制备成功。经夹脊电针治疗7天后，Model+EA 组大鼠脊髓组织DR6蛋白表达低于Model 组，差异有统计学意义（P＜0.05）（见图4）。

图4 各组大鼠脊髓组织DR6表达变化（n=6）

2.5 脊髓组织中少突胶质细胞标志蛋白CNpase 的表达变化

Sham组和Sham+EA 组大鼠脊髓组织中CNpase蛋白表达量维持在稳定水平，假手术操作及电针治疗并未对正常大鼠脊髓组织CNpase 表达产生影响；Model组大鼠脊髓组织CNpase蛋白表达降低，差异有统计学意义（P＜0.05），经夹脊电针治疗7 天后，Model+EA 组大鼠脊髓组织CNpase 蛋白表达高于Model 组，差异有统计学意义（P＜0.05）（见图5）。

图5 各组大鼠脊髓组织CNpase蛋白表达变化（n=6）

2.6 脊髓组织中DR6 mRNA表达水平变化

Sham 组和Sham+EA 组大鼠脊髓组织中DR6 mRNA 表达维持在少量稳定的低水平，假手术操作及电针治疗并未对正常大鼠脊髓组织DR6 表达产生影响；Model 组大鼠脊髓组织DR6 mRNA 表达水平显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05），表明模型制备成功。经夹脊电针治疗7 天后，Model+EA 组大鼠脊髓组织DR6 mRNA 表达低于Model 组，差异有统计学意义（P＜0.05）（见图6）。

图6 各组大鼠脊髓组织DR6 mRNA表达水平变化（n=6）

3 讨论

脊髓损伤病理过程包括原发性损伤和继发性损伤两个阶段[9]，原发性损伤是不可逆的瞬间性的机械损伤包括撕裂伤、剪切伤、暴力伤等，继发性损伤往往在原发性损伤基础上数分钟到数周微环境中发生一系列如组织水肿、局部缺血、脂质过氧化、兴奋性氨基酸毒性、离子紊乱、炎症反应、神经细胞凋亡等机制，产生一系列的级联反应导致自身破坏的过程，是最具破坏性的阶段[10]，因此近年来，针对继发性损伤后微环境的变化及调控成为了研究脊髓损伤的热点。研究表明，针灸治疗对于SCI 所造成截瘫的恢复有肯定的促进作用，同时改善二便功能、缓解肢体痉挛、减轻截瘫性疼痛等并发症、后遗症等方面有较好的疗效[11]。夹脊电针是在针刺夹脊穴后，将导线正负极交换通量以输出脉冲电流，在脊髓损伤严重的脊髓组织及周围组织针刺穴位后再提供电场的刺激，使与之相互作用直接而形成一种利于刺激轴突神经细胞再生、促进损伤神经功能快速恢复功能的刺激环境之一[12]。

脊髓损伤后肢运动功能会严重减退，BBB 评分法是应用最为广泛，客观性较强的评价动物肢体运动功能量表[13]；本研究通过BBB 评分观察大鼠肢体运动功能状况，结果显示Model 组大鼠造模后出现双侧后肢瘫痪，活动明显受限症状，同时观察脊髓损伤后大鼠脊髓组织病理发现脊髓损伤后大鼠脊髓组织出现疏松，脊髓组织出现大量出血灶及淋巴细胞浸润，神经轴突因外伤、挤压或缺血而受损，灰质内有神经元残存，核浓缩，体积变小甚至消失，白质内可见大量的小脂滴形成大量的空泡细胞。经夹脊电针治疗7 天后，大鼠BBB 评分升高，可活动一定范围。脊髓组织出血点面积减少，淋巴细胞浸润减少，神经元细胞出现修复现象，出现一定量髓鞘再生，表明夹脊电针能改善脊髓损伤大鼠脊髓组织病理性损伤，进而改善大鼠后肢运动功能。这与课题组前期研究结果较为一致[14-15]。

在中枢神经系统发育髓鞘形成过程中，少突胶质细胞祖细胞（OPCs）增殖并迁移到最终目的地，最终分化为成熟的少突胶质细胞，形成髓鞘轴突[16]。脊髓损伤后，髓鞘出现大量死亡，轴突脱髓鞘，进而影响肢体功能，因此少突胶质细胞的成熟活化在髓鞘再生中起到重要作用[17-19]。DR6 是少突胶质细胞的一个负性调控因子，其在大脑及神经细胞中有大量表达，且与神经元细胞和神经轴索的退化凋亡密切相关[20]。研究发现在少突胶质细胞中过表达DR6 能导致神经元的凋亡，但抑制DR6 表达可促进少突胶质细胞成熟、髓鞘形成及再生，DR6 基因缺失的小鼠在两种脱髓鞘模型中均表现出增强的再髓鞘形成[3]，因此调控DR6 表达对于少突胶质细胞成熟活化，进而改善髓鞘再生起到了关键的作用。本研究观察了夹脊电针对脊髓损伤大鼠脊髓组织DR6 蛋白及DR6mRNA 表达的影响，同时通过检测少突胶质细胞标志蛋白CNpase 蛋白的表达，CNPase是一种在中枢和外周神经系统中高水平存在的酶，是少突胶质细胞的特异性标记蛋白[21]。试图阐明夹脊电针对少突胶质细胞活化的调控作用，马睿杰等[22]研究同样发现电针可促进脊髓损伤组织成熟少突胶质细胞的增殖分化，进而促使脊髓损伤后神经功能恢复，与本研究发现电针促进少突胶质细胞分化结果相一致。

总之，电针夹脊穴治疗脊髓损伤的作用机制可能通过抑制脊髓组织中DR6 mRNA 及蛋白表达，促进少突胶质细胞活化，改善损伤脊髓组织损伤微环境，促使髓鞘形成与再生，改善脊髓损伤，但在本课题中对DR6 与少突胶质细胞之间具体调控机制尚未阐明，需进一步的深入研究。