猪场PRRSV攻毒试验探索及阳性血清的制备

施莹　谢孟娟

摘要：良圻原种猪场长期采用血清驯化的方式进行猪蓝耳病的防控，并摸索出一定的经验，在此基础上开展本试验。近期，经PRRSV阳性样品采集、PRRSV测序和同源性对比确认猪场可能存在2种以上的PRRSV毒株，为了制备优势毒株血清，本试验对双阴性猪只（35日龄）进行PRRSV攻毒试验，在对PRRSV攻毒试验进行探索的同时，为后期血清驯化提供技术支持。

关键词：PRRSV；攻毒试验；阳性血清；制备

猪蓝耳病又称猪繁殖与呼吸综合征（PRRS），是由猪蓝耳病病毒（PRRSV）引起的一种高接触性传染病，其感染性无品种、年龄和用途的差异，对所有猪均能造成不同程度的危害，为猪场的发展带来直接和间接经济损失的同时，还致使猪场长期发展受到制约。多年来，本猪场也一直采用血清驯化的方式来控制猪蓝耳病，取得了较好的防控效果。一是通过人为干预控制猪群的感染时间，切实做好监控和应对措施，尽可能使猪群保持一致的状态。二是选用本场的病毒株来进行血清驯化，借助驯化血清的单一性获得一致性的抗体，提升猪群的免疫力，提升母猪的繁殖性能和生产性能，为猪场长期健康发展夯实基础。

1 试验目的

1.1 PRRSV攻毒试验

经过猪场血清驯化的宝贵经验，现已掌握猪蓝耳病样本Ct值在23左右的时候，直接将血清稀释500倍进行血清驯化效果最佳。为进一步验证是否CT值为23的血清稀释后攻毒效果更佳，并更明确PRRSV攻毒试验的要点，特开展此试验，用两个不同Ct值的血清对抗原抗体双阴性猪（35日龄）进行攻毒，跟踪攻毒后临床症状和抗原抗体的变化情况，为猪场血清驯化提供技术指导和数据支持。

1.2 阳性血清的制备

近期，本猪场血清驯化不稳定，为了确认猪场存在的PRRSV毒株种类，采集阳性样品进行测序、同源性比对，发现猪场可能存在2种以上的PRRSV毒株。为满足血清驯化的血清要求，决定重新进行攻毒并制备血清。选用PRRSV双阴性猪进行PRRSV攻毒试验，对攻毒前后的PRRSV进行测序和基因比对，确定同源性一致、Ct值满足要求后杀猪取血制备血清，为后期猪场的血清驯化提供安全血清。

2 试验材料

猪场制备的PRRSV血清，选取2022年9月29日与本猪场优势毒株序列一致的流产母猪耳号2B26-Y333702血清（CT值19.92），公司内部保存；PRRS抗原抗体双阴猪，35日龄，来源于本猪场；抗原检测试剂盒（ANIMAL-20220919），抗体检测试剂盒（ID.Vet-I0701，IDEXX-EU610）；仪器ABI 7500、ABI QuantsudioTM5、BioTek 50TS、BioTek酶标仪ELX800。

3 试验方法

3.1 猪场毒株种类鉴定

采集6份阳性样品进行PCR扩增后送测序公司进行测序，用DNAstar lasergene与本猪场优势毒株进行同源性对比。

3.2 PRRSV攻毒方法

每只猪编号、对应的血清及攻毒时间如表1，另设置一只猪（FD013861）不进行攻毒，与FD013890、FD013899共同饲喂，观察其能否被自然感染，作为血清制备的备选。

3.3 采血检测

攻毒后每天进行采血和检测，时间为12d，检测Ct值，以此判断抗原结果；检测抗体S/P值，以此判断抗体结果。需要注意，由于本试验进行两次攻毒，第二次攻毒（第3d）前要先采血测定后再进行攻毒，以免攻毒影响当日检测结果。

3.4 攻毒前后同源性对比

对两只试验猪的阳性样品进行PCR扩增后送测序公司进行测序，用DNAstar lasergene与本猪场优势毒株进行同源性对比。

4 结果和分析

4.1 猪场毒株鉴定结果

本场6个样品测序后，跟现用驯化血清进行两两相互比对，同源性从83.0%～100%不等（见图1），整体分为两大类，表明猪场内至少存在2种不同PRRSV，为防沿用自存的血清导致血清驯化失败，猪场决定重新制备血清。

4.2 攻毒前猪只PRRS监测情况

PRRS双阴猪检测情况见表2，通过检测抗原抗体双阴性，证明试验动物符合PRRS攻毒要求；通过检测证明猪只不存在非瘟、PED、TGE、PDCV、豬瘟、猪伪狂犬等影响PRRS血清制备的疾病因素，证明试验动物符合制备血清的要求。

4.3 攻毒后PRRS抗原监测情况

PRRS双阴性猪攻毒后Ct值检测结果及PRRS抗原结果见表3。本试验中通过试剂盒Ct值的测定对抗原结果进行判定，结合本试验检测结果，Ct值≤38或有明显的指数增长期判定为阳性；Ct值＞38的样本建议重做，重做后无CT值判定为阴性，否则判为阳性。由表3分析，PRRSV攻毒后，FD013890第4d开始呈抗原阳性；FD013899从第2d起即开始呈现抗原阳性；阴性对照则截至12d抗原皆为阴性。

4.4 攻毒后PRRS抗体监测情况

PRRS双阴性猪攻毒后PRRS抗体检测情况见表4。由表4分析，PRRSV攻毒后，FD013890第12天开始呈抗体阳性；FD013899从第6d起即开始呈现抗体阳性；阴性对照至试验结束未呈现抗体阳性。

4.5 攻毒后临床症状

FD013890攻毒后第3d开始出现嗜睡、喘气异常等症状并伴随体温升高至40℃以上；FD013899攻毒后第5d开始出现嗜睡、喘气异常等症状并伴随体温升高至40℃以上；阴性对照未出现临床症状。

4.6 攻毒前后同源性比对

第12d杀猪取血，对两只攻毒猪的血清进行测序后，和本猪场优势毒株两两相互比对，同源99.9%、100%，表明攻毒前后同源性一致，可以用于血清制备。

4.7 血清制备

第12d，以Ct值为判定依据（表3），Ct值＜23的猪只作为血清制备的选择，确定攻毒猪FD013899用来制备血清，按照血清制备方法制备，血清制备量及处理保存方式见表5。

5 讨论

5.1 PRRS抗原方面

通过本试验发现，攻毒猪13890和13899抗原转阳均早于抗体转阳；猪只13899攻毒后较13890攻毒后抗原、抗体转阳更早；猪只13899抗原与抗体转阳间隔时间更短。证明，CT值23左右的血清用于本场血清驯化，猪只更早感染，可以缩短感染时间，降低生产成本，提高血清驯化的效率。阴性对照猪FD013861抗原至试验结束仍未转阳，分析原因可能是猪蓝耳病的潜伏期差异较大，引入感染后，最短3d，最长能达到37d，并且感染时间也受病毒株影响，此毒株可能毒性较弱，且健康猪只抵抗力强，因此自然感染时间相对长甚至不感染。在后期试验中可以延长试验周期或增加平行样品数量，以此增加检测数据量，通过分析提高可信度。

5.2 PRRS抗體方面

攻毒猪13890抗体转阳较抗原转阳延后8d，13899抗体转阳较抗原转阳延后4d，鉴于抗体转阳较抗原转阳的滞后性，在临床中抗原检测更可靠，并常将抗体检测作为是否感染过PRRSV的依据。在临床检测中，要综合判断，不要只依赖于单一的检测手段来判定猪只的感染状态，以免造成误判。

5.3 PRRSV同源性检测的意义

一般来说，PRRSV序列分析同源性越高，变异越小，对猪场造成的危害相对较小。为了提高防控效果，应该对猪场PRRSV的种类有一个清晰的认识，加强对驯化血清的管理，对病料进行测序分析，选择优势毒株，筛选同源性高的血清进行血清驯化，保证驯化效果。

5.4 血清驯化的优点和注意事项

血清驯化选用本猪场的毒株，防控时具有很好的交叉保护能力，能够有效防控；对于猪蓝耳病毒活跃的母猪场，血清驯化可以快速控制蓝耳病，及时清除猪群的病毒量，大大降低损失；血清驯化后的猪场能够维持较长时间的稳定性，降低猪蓝耳病的管控难度；血清驯化成本低，对于猪场效益提升和其他疾病的防控有很大的借鉴作用。

参考文献

[1] 刘英杰，齐六卫，董彦龙，等.吉林某规模化猪场的猪蓝耳病抗原抗体分析及防控建议[J].猪业科学，2022，39（11）：77-79.

[2] 张天宝，薛忠，张振玲.某猪场猪蓝耳病暴发案例调查与防治[J].猪业科学，2022，39（8）：78-80.

[3] 沈叶盛，耿国芹，李焱，等.猪蓝耳病的防控要点[J].山东畜牧兽医，2022，43（6）：36-37.