高迁移率族蛋白B1在牙周炎中作用机制的研究进展*

邹浩冬，杨 飞，张莞嫣，王 拓，吴 艳

川北医学院附属医院 口腔科（南充 637000）

牙周炎指发生在牙周支持组织的慢性炎症性疾病，是导致牙齿缺失的主要原因。我国牙周炎发病率为70%～90%。现代观点认为，牙周炎发生的始动因素为菌斑，宿主对菌斑微生物及其产物的免疫应答反应也是牙周支持组织破坏的重要因素[1]。在牙周炎的发生发展过程中，有多种炎症细胞和炎性介质的参与，其中1 个重要的细胞因子是高迁移率族蛋白B1（high mobility group box 1，HMGB1）。HMGB1 在细胞核内含量丰富并参与基因调控，在细胞外作为一种重要的晚期炎性介质和细胞因子，参与了肺炎、胰腺炎、关节炎及脓毒症等疾病的发生发展[2]。近期有研究[3-4]表明，HMGB1 与牙周炎关系密切。本文对HMGB1 的生物学特性及其与牙周炎的相关性研究作一综述，以期为HMGB1 与牙周炎作用的相关受体和信号通路的病理机制提供依据，并为牙周炎的临床诊治提供新思路。

1 HMGB1 概述

HMGB1 广泛表达于有核哺乳动物细胞中，其是一种调节转录的高度保守核蛋白，也是一种损伤相关分子模式（damage associated molecular patterns，DAMPs）。在细胞核中，HMGB1 与DNA结合，作为结构因子在基因复制、转录和修复过程中发挥重要作用[5]；在细胞外，通过自身或与细胞因子及其他外源性和内源性分子的复合物刺激先天免疫系统，介导炎症和自身免疫性疾病[6-7]。

人HMGB1 基因位于13q12 染色体，有215 个氨基酸残基，由2 个带正电荷的同源DNA结合域（A盒，1～79 氨基酸残基；B盒，95～163 氨基酸残基）和c端带负电荷的酸性尾巴（186～215 氨基酸残基）组成[8]。HMGB1 的致炎作用主要存在于B盒中，最显著的促炎功能定位于该结构域的20 个氨基酸残基片段（残基89～108），在受到刺激时诱导促炎信号；A盒可特异性拮抗B盒的促炎活性[9]。根据A盒第23、45 位点的半胱氨酸残基（C23、C45）和B盒第106 位点的半胱氨酸残基（C106）不同的氧化还原状态，HMGB1 可分为氧化型HMGB1（oxidized HMGB1，ox-HMGB1）、二硫键型HMGB1（disulfide HMGB1，ds-HMGB1）和完全还原型HMGB1（fully reduced HMGB1，fr-HMGB1），这3 种保守半胱氨酸残基的氧化还原状态会调节HMGB1的受体结合能力和生物学功能[10-11]。Andersson等[12]研究表明，二硫键的亚型对组织有损伤，完全还原的亚型支持组织再生，而完全氧化的亚型缺乏确定的功能。Yang等[13]研究表明，能刺激细胞因子释放的是ds-HMGB1（C23 和C45 间的二硫键，C106 保持其还原硫醇形式），ds-HMGB1 与Toll样受体4/髓样分化蛋白-2（Toll-like receptors 4/Myeloid differentiation protein-2，TLR4/MD-2）复合物中的MD-2 结合，并在培养的巨噬细胞中诱导肿瘤坏死因子的释放和核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）信号通路的激活。HMGB1 分泌到细胞外主要有两种方式：1）细胞坏死或凋亡时通过破裂的细胞膜被动释放HMGB1；2）单核细胞、巨噬细胞、内皮细胞、NK细胞、树突状细胞参与的主动分泌HMGB1。HMGB1 的乙酰化程度决定释放方式[14-15]，被动释放到细胞外的HMGB1 可作为坏死细胞的死亡标记物，而主动分泌的HMGB1 是机体炎症反应的关键分子[16]。

2 HMGB1 与牙周炎相关受体和信号通路

细胞外HMGB1 主要通过与受体结合发挥促炎作用，迄今研究发现的HMGB1 受体已超过15 种[17]，其中与发挥促炎作用关系最密切的是晚期糖基化终末产物受体（receptor for advanced-glycation endproducts，RAGE） 和Toll样 受 体（Toll-like receptors，TLRs）。HMGB1 与RAGE的结合位点位于残基150～183，而残基89～108 和残基7～74 分别负责结合TLR4 和p53 反式激活结构域[18]。

2.1 RAGE

RAGE是一种多配体模式识别受体，与多种慢性炎症反应相关，在单核细胞、巨噬细胞、内皮细胞、神经元及各种肿瘤细胞上均能检测到RAGE表达。RAGE是一种跨膜蛋白，分为细胞外、跨膜和细胞内片段[19]；其最初被认为仅是晚期糖基化终产物（advanced glycation endproducts，AGEs）的受体。但Hudson等[19]研究表明，RAGE除了与AGEs特异结合，还可与HMGB1、S100、Aβ等配基相结合，Hori等[20]研究表明，HMGB1 与RAGE的结合能力高于AGEs。RAGE的配体结合可激活两条主要途径：CDC42/Rac途径和经丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPKs）最终激活的NF-κB信号通路[21]。Andersson等[12]研究发现，HMGB1 与RAGE受体相互作用导致炎症介质产生，HMGB1 能单独或和其他配体结合形成HMGB1 复合物后与RAGE结合，被内吞进入溶酶体系统；HMGB1能渗透酸性溶酶体的膜，使HMGB1 及HMGB1 运输的配体避免降解和泄漏，接着配体接近胞质和核膜上的同源受体，相互作用合成增强炎症的介质，加重炎症反应。

HMGB1/RAGE轴与多种细胞效应有关，如诱导炎症反应和血管生成、组织重塑和刺激细胞分化再生[22]。细胞膜上的RAGE在正常生理条件下处于较低水平，当机体的炎症因子增加或机体受到创伤等异常状况时，HMGB1 的含量增加，RAGE的表达上调[19]，当RAGE与配体结合时，能促进MAPK p38 蛋白的下游磷酸化，从而增加NF-κB信号通路的表达，NF-κB通过调节靶基因和触发相关的炎症及自身免疫反应来促进肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素-1β（interleukin-1，IL-1β）、HMGB1 等炎症因子和细胞间黏附分子-1（intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1）、血管细胞黏附分子-1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）等黏附分子的表达，从而导致持续的组织损伤。HMGB1 介导的RAGE刺激可通过上调RAGE表达及促进RAGE与其配体的结合来放大此种反应，形成1 条正反馈炎性环路，因此HMGB1 激活RAGE可以启动和维持促炎表型[23-24]。Qin等[25]研究表明，HMGB1 蛋白的促炎活性与所含的脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）水平相关，HMGB1与RAGE结合后增强LPS在体内和体外诱导促炎细胞因子的活性。胱天蛋白酶-1 及胱天蛋白酶-11 是介导细胞焦亡的关键因子，Lamkanfi等[26]和赵昕等[27]研究发现，对C57BL/6 小鼠使用胱天蛋白酶的泛抑制剂zVAD-fmk抑制胱天蛋白酶-1 及胱天蛋白酶-11介导的细胞焦亡后，其血清中HMGB1 的水平显著降低。HMGB1 能在细胞外直接与LPS结合，RAGE将HMGB1-LPS复合物内化为内溶酶体，HMGB1 破坏溶酶体膜的稳定性，导致LPS释放到细胞质基质中以激活胱天蛋白酶-11 独立组装成炎症小体，对Gasdermin D（GSDMD）蛋白的特定位点进行切割，GSDMD活化引发质膜穿孔，进而发生细胞焦亡[28]。

HMGB1 作为一种重要的胞外晚期炎性递质，参与了牙周炎的发病过程。Ito等[29]研究表明，在炎症牙龈组织中，HMGB1 和RAGE表达量升高，且人牙龈上皮细胞和成纤维细胞能通过HMGB1/RAGE对IL-1β的刺激产生免疫应答，促炎因子IL-1β释放到细胞外，在牙周组织中介导一系列炎症反应，包括诱导白细胞的驱化作用、增加基质金属蛋白酶的产生、导致结缔组织破坏、促进前列腺素E2 的产生使破骨细胞增多和加重破骨性骨吸收等，促进牙周炎的病理进程，最终导致牙齿松动、脱落[30]。在牙周组织中，牙龈上皮细胞、牙龈成纤维细胞及牙周膜干细胞等经过LPS/HMGB1/RAGE激活胱天蛋白酶-11 发生细胞焦亡，直接造成牙周组织和牙龈上皮屏障破坏、附着丧失和牙槽骨吸收等；同时巨噬细胞发生焦亡所释放的大量促炎因子及趋化因子会引起牙周组织中大量炎症细胞的聚集，并伴随基质金属蛋白酶、胶原酶的分泌，破骨细胞的分化和成熟，引起牙龈和牙周膜组织中的胶原降解，从而间接损伤牙周组织[31]。Plemmenos等[32]研究表明，在炎症情况下AGEs/RAGE轴在牙龈成纤维细胞、牙周膜细胞、上皮细胞、内皮细胞中均有高表达，引起以上细胞的焦亡，导致牙周炎症加重。因此推断在牙周组织中HMGB1 和RAGE的结合也能触发牙周组织中的炎症反应，破坏牙周膜成纤维细胞的活力，并对骨细胞的骨代谢产生负面影响，从而造成牙槽骨的吸收。但有体内外实验[22]结果显示，HMGB1 和RAGE通过影响宿主炎症免疫反应的平衡，包括巨噬细胞迁移和M1/M2 极化、间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）标志物表达，共同调节骨基质沉积。因此笔者推测HMGB1可能通过这种路径促进牙槽骨成骨过程，参与牙周组织的修复再生。

2.2 TLRs

TLRs是I型跨膜超家族成员，是一种模式识别受体，能检测病原体相关分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs），并 感 知DAMPs模 式，引发机体的先天免疫反应[33]。TLRs的信号传导通常分为两种不同的途径，即基于髓样分化因子88（myeloid differentiation protein，MyD88）及TIR结构域衔 接 蛋 白（TIR-domain-containing adaptor inducing interferon-β，TRIF）对下游信号级联的募集[34]。HMGB1能够与TLR2、TLR4 和TLR9 结合，结合后激活MyD88以激活干扰素调节和NF-κB通路，产生炎症和免疫应答的细胞因子和趋化因子[35]。TLR4/MD-2是巨噬细胞中HMGB1 诱导产生的受体复合物，He等[36]和Sun等[37]研究结果表明，HMGB1/TLR4/MD-2的相互作用通过HMGB1/TLR4 结合A盒结构域启动；且一旦靠近，HMGB1 B盒结构域与MD-2 结合，诱导TLR4/MD-2 复合物的二聚化，引起细胞内下游炎症通路的激活和炎性细胞因子的释放。在静息状态下，NF-κB与抑制剂分子NF-κB抑制物（inhibitor of NF-κB，IκB）结合，并以非活性复合体的形式存在于细胞质中。HMGB1 与TLR4 或RAGE结合后，快速将信号传导至IκB激酶复合物（IκBkinase complex，IKK）上，随后IκB蛋白磷酸化成为蛋白酶体并被快速降解，导致NF-κB二聚体释放并易位到细胞核中，在核易位之后，与特定的DNA位点结合，激活NF-κB调节的靶基因转录，通过调节靶基因和触发相关炎症、自身免疫反应来促进炎症因子（如TNF-α、IL-1β、HMGB1等）的表达，从而导致持续的组织损伤。当NF-κB被激活时，其可促进RAGE与其配体的结合，并进一步促进细胞因子和组织因子的持续表达，形成1条正反馈炎症环路[38-39]。同时在白细胞中，HMGB1 可与TLR2 结合进行信号传导激活ICAM-1 受体CD11b/CD18，CD11b/CD18 和ICAM-1 之间的相互作用也能导致NF-κB激活[21]。除TLR2外，RAGE还有助于CD11b/CD18在嗜中性粒细胞上的激活。因此，HMGB1 与RAGE和TLRs结合激活的信号通路间的相互作用可能发生在不同水平上，且均对NF-κB起着至关重要的作用，共同维持着自分泌或旁分泌正反馈炎症通路。巨噬细胞是主要的防御细胞，炎症微环境下，被激活的巨噬细胞不仅能向细胞外环境分泌HMGB1，还表达多种能与HMGB1 结合的表面受体。Li等[40]通过体内外实验观察到，重组HMGB1 的刺激增加了M1 型巨噬细胞来源的炎症因子（TNF-α、IL-6 和MCP-1）水平和M1 型相关mRNA的表达，引起M2 型相关细胞因子（IL-10）水平和M2 型相关mRNA的表达降低；抗HMGB1 刺激则产生相反的结果。同时他们还证明了HMGB1 介导巨噬细胞中双链RNA活化蛋白激酶R（protein kinase R，PKR）的激活，并通过TLR2 和TLR4 介导的NF-κB信号通路作用于巨噬细胞，诱导巨噬细胞向M1 型极化，产生大量的炎症因子，促进炎症发展。

在牙周组织存在炎症的情况下，牙龈上皮细胞受LPS、丁酸等刺激释放HMGB1，随后HMGB1 结合RAGE、TLR4/MD2、TLR2 等受体，促进自分泌/旁分泌信号传导，通过激活NF-κB信号通路刺激巨噬细胞、中性粒细胞等产生IL-1β、IL-6、TNF-α和HMGB1 等细胞因子；同时LPS与HMGB1 结合后通过TLR2、TLR4途径可促进M1 型巨噬细胞极化，极化的巨噬细胞通过MyD88 进行上游信号的传递，使NF-κB信号通路激活。因此HMGB1 处在炎症环路中，其是刺激TNF-α和IL-1β等炎症因子分泌的有效刺激因子；这些促炎细胞因子又会诱导其他牙周组织（如牙龈成纤维细胞、牙周韧带等）进一步产生HMGB1[29]，炎症进一步加重导致牙周组织的进行性破坏。牙周膜干细胞（periodontal ligament stem cells，PDLSCs）是存在于牙周膜中一种具有未分化间充质细胞特性的干细胞，能维持牙周膜的稳定性，且能分化成具有不同功能的成熟细胞，具有修复和再生受损牙周骨组织的成骨潜力。TLR4 是内毒素的主要受体，Wang等[41]研究结果显示，LPS通过LPS/TLR4 信号传导下调肾上腺素B2，抑制PDLSCs的成骨分化，因此HMGB1 可能与LPS结合通过此途径影响牙周组织的再生修复。Kim等[42]研究发现，HMGB1处理人PDLSCs后，TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-11 和IL-17 mRNA的表达增加，它们被称为细胞破骨因子，对PDLSCs的成骨分化具有抑制作用，有助于破骨细胞分化/活化，与牙周炎相关的骨质流失密切相关，由此推断HMGB1 可通过结合TLRs或RAGE参与牙槽骨的破坏过程，但具体机制尚未明确。

2.3 负性受体

CD24 和TIM-3 是与HMGB1 结合的负性受体，负向调节HMGB1 激活的各项机体反应[18]。CD24 又称热稳定抗原，是一种高度糖基化的糖基磷脂酰肌醇锚定表面蛋白，1987 年被发现，并与几种损伤相关模式分子相关，如HMGB1、热休克蛋白70 和热休克蛋白90。Chen等[43]研究数据也揭示了CD24 能负向调节其刺激活动，并抑制NF-κB的激活，参与抑制感染、败血症和肝损伤等破坏性炎症反应。Chiba等[44]研究证明，TIM-3 是HMGB1 的受体，TIM-3 可能通过调节核酸内切酶（如TREX1、FEN1）的活性来影响HMGB1 介导的核酸识别，这对于介导宿主DNA的降解至关重要。同时TIM-3 可抑制核内体中其他HMGB1 受体（如RAGE和TLR4）的活性。除在核酸介导的先天免疫系统中的作用外，TIM-3 还可调节HMGB1 的基因转录、自噬和氧化应激等其他功能。

CD24 是重要的副调节因子，在健康牙龈组织的结合上皮和沟内上皮中存在特征性高表达。研究[7，45]表明，CD24 抗体滴度与牙周病的严重程度呈负相关，CD24 与先天性免疫细胞上Siglec-10 相互作用，可抑制HMGB1 诱导的NF-κB信号通路的激活及下游促炎细胞因子的释放，从而降低对牙周组织的破坏。

3 HMGB1 在牙周炎治疗中的研究

部分研究[29-32]证实，HMGB1 参与了牙周炎的发生发展，通过抑制HMGB1 的功能以治疗牙周炎成为目前研究的热点。二甲双胍是临床治疗2 型糖尿病的一线降糖药物，除能降血糖外，还具有抗炎作用，可与HMGB1 结合并抑制HMGB1 的促炎活性。Araújo等[46]研究表明，二甲双胍在结扎诱导的牙周炎大鼠中表现出抗炎、抗氧化活性，并能减少骨质的流失。Mollica等[47]研究发现，甘草酸能抑制HMGB1 的趋化能力及有丝分裂活性，对细胞核内DNA结合功能具有抑制作用，还对全身炎症性疾病起抗炎作用。Ideguchi等[48]建立实验性牙周炎小鼠模型以观察甘草酸对牙周炎症的影响，发现甘草酸以剂量依赖性方式抑制髓过氧化物酶的活性，减少破骨细胞和中性粒细胞的数量，从而抑制牙周炎症的发展。因此甘草酸也是各种牙膏和漱口水的成分。Yoshihara-Hirata等[4]采用牙龈卟啉单胞菌浸泡的结扎物在小鼠中诱导实验性牙周炎，通过免疫荧光分析，在牙周炎模型小鼠的牙龈上皮中证实了HMGB1 的细胞外移位，全身注射抗HMGB1 中和抗体可显著抑制HMGB1 移位，抗HMGB1 抗体可抑制牙周炎症、IL1β和C-X-C基序趋化因子配体1 的表达、中性粒细胞的迁移等。因此认为HMGB1 是牙周炎发生和发展的关键调节因子，并且对将来牙周炎的治疗提供了新的思路。

4 小结与展望

HMGB1 作为一种炎症因子，通过不同形式与不同的受体、配体结合激活不同的信号通路，可形成正反馈炎症促进环路，与牙周组织的病理化过程密切相关；同时可能参与了牙周组织的修复，但其在牙周炎中的释放模式及具体作用机制尚需行进一步探索。HMGB1 阻断剂的使用可降低炎症反应的级联放大效应，进而缓解牙周炎症的进展。因此HMGB1 的表达量有可能作为牙周炎的临床检测指标来判断患者的病变程度及治疗效果，可能是牙周炎潜在的治疗靶点。未来仍需进一步研究HMGB1 相关信号通路及其参与牙周炎的具体作用机制，以期研制HMGB1 相关抑制剂或调控因子，为牙周炎的精准靶向治疗开辟新思路。