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坏死性凋亡与铁死亡在急性肾损伤中的作用机制研究进展

2023-09-01王书琦综述武卫东审校

疑难病杂志 2023年7期
关键词:坏死性过氧化脂质

王书琦 综述 武卫东 审校

急性肾损伤(acute kidney injury,AKI)一直是世界范围内严重危害健康的疾病,也是临床研究的焦点。近年来,AKI的发病率和病死率呈上升趋势[1]。AKI增加了慢性肾脏疾病( kidney disease,KD)、心血管疾病和终末期肾脏病(end stage renal disease, ESRD)的潜在风险[2]。AKI的治疗方法主要包括纠正电解质紊乱、避免肾毒性药物和肾脏替代治疗[3]。然而,AKI发生发展的具体机制尚不清楚。目前还没有有效的治疗方法来预防AKI的发生。因此,有必要深入研究AKI的具体发病机制,为临床治疗开发新的治疗方法。

细胞死亡是每一个细胞的终点,是无法逆转的功能终结,研究认为,细胞凋亡是急性肾损伤(AKI)和肾移植中大多数死亡细胞的罪魁祸首[4]。在多细胞生物体中,程序性细胞死亡在调节个体细胞发育和成体生活中起着重要作用。已发现多种机制的程序性细胞死亡以不同方式发挥作用。细胞凋亡是由半胱氨酸蛋白酶(caspase)介导的一种程序性细胞死亡。如果细胞凋亡是AKI的驱动机制,caspase的药物抑制将防止肾小管细胞死亡,但这一点尚未得到验证。细胞凋亡的干预对AKI的预后并无改善,因此,在过去的十年里,人们提出了其他细胞死亡途径。现有研究表明,坏死性凋亡与铁死亡等都参与AKI的发生和发展[5]。本文对坏死性凋亡及铁死亡途径在AKI中的作用机制研究进展进行综述。

1 坏死性凋亡

当细胞受到过多的应激,如热、缺血和感染时通常会发生坏死。传统上,坏死被认为是被动和无规则的,与传统观念相反,所谓坏死性凋亡,是一种受控制的细胞死亡形式,形态学上表现为细胞膜穿孔,胞浆肿胀,线粒体功能障碍,核染色质缺失,质膜发生破裂,胞内内容物外溢[6]。由于在细胞死亡过程中,形态与坏死极为相似,被称为坏死性凋亡。坏死性凋亡可被死亡受体的配体激活,并在细胞凋亡不足的情况下诱导死亡受体配体的表达。死亡受体配体激活坏死性凋亡需要受体相互作用蛋白1(RIP1)的激酶活性,RIP1介导受体相互作用蛋白3(RIP3)和混合谱系激酶域样蛋白(mixed lineage kinase domain-like,MLKL)的激活,RIP3和MLKL是坏死性凋亡的2个关键下游介质。核黄素是RIP1的小分子抑制剂,其抑制RIP1的作用可以阻止坏死性凋亡的发生和细胞的存活。

1.1 坏死性凋亡的传导通路 过去10年,坏死性凋亡途径的复杂机制细节已被阐明[7],肿瘤坏死因子(TNF)家族成员、Toll样受体激活(TLRs)及其他病原微生物等因素都可能触发坏死性凋亡,目前TNF与其受体结合所介导的激活途径研究较多。这种死亡通过肿瘤坏死因子受体(tumor necrosis factor receptor-1,TNFRI)发出信号死亡,形成肿瘤坏死因子受体相关死亡域蛋白(tumor necrosis factor receptor associated death domain protein,TRADD),TRADD 募集受体相互作用蛋白激酶(RIPK),当RIPK1被去泛素化酶(cylindromatosis,CYLD)去泛素化,同时TRADD解离,结合Caspase-8和Fas相关死亡域蛋白(FADD),若Caspase-8活化,启动细胞凋亡。若Caspase-8被抑制,RIPK1募集RIPK3通过磷酸化形成被称为“坏死小体”的复合物[8],移位至细胞膜,导致其破裂,进而触发凋亡性坏死。因此,Caspase-8似乎既可以作为细胞凋亡的起始者,也可以作为坏死性凋亡的抑制者。

ESCRT-Ⅲ复合体是一种膜修复机制,通过从细胞表面萌发含有磷酸MLKL(PMLKL)的囊泡来对抗坏死性凋亡的执行,从而保持质膜的完整性。 研究表明,MLKL是唯一已知的坏死性凋亡的下游效应因子[9],近年来通过越来越多的证据表明,PMLKL是执行坏死性凋亡所必需的,RIPK3可能不仅可以作为坏死性凋亡的调节靶点,还可以作为由坏死性凋亡引起的疾病的生物标志物。有关研究表明AKI或败血症危重患者血浆中的RIPK3水平与疾病活动呈正相关[10-11]。

1.2 坏死性凋亡与AKI Linkermann等[12]在缺血/再灌注损伤(ischemia/reperfusion injury,IRI)模型中观察到RIPK1、RIPK3表达升高,在RIPK3二聚化后20 min内应用坏死性凋亡抑制剂necrostatin-1(Nec-1)可以明显改善肾功能,RIPK1抑制剂如索拉非尼和苯妥英钠[13],均可通过抑制RIPK1活性而缓解IRI所致的AKI。

顺铂的毒性长期以来一直被认为是一种肾毒性和DNA损伤的化合物。最近,由Rob-ERT Safirstein团队发现,在最初应用顺铂后,肾脏中RIPK3和MLKL蛋白上调,增加了对反复损伤的敏感性,从而增加了对坏死性凋亡的敏感性。TNFR超家族成员Fas也被证明在离体肾小管中介导顺铂毒性[14]。研究发现使用Nec-1可以延缓肾小管上皮细胞的死亡,一定剂量的汉黄芩素可延缓顺铂诱导的AKI。在结石所导致AKI的样本中,研究者通过免疫荧光法检测到了磷酸化的MLKL。当晶体引起的坏死最初被认为是坏死性凋亡的结果时,研究者发现肾小管上皮细胞中RIPK1 和RIPK3蛋白的表达可被晶体诱导[15],但尚不清楚多大剂量的叶酸(FA)可能会诱导肾腔内的结晶,而高剂量的FA可能会进一步破坏肾小管上皮。在FA-AKI小鼠模型中观察到高水平的肾脏脂质过氧化。给予Fer-1后肾脏的功能和结构较对照组有明显缓解的趋势。进一步证实,在晶体诱导的AKI过程中,依赖RIPK3的中性粒细胞胞外陷阱(Nets)的释放可以成为坏死性凋亡抑制剂的靶点[16]。另有研究发现,依赖RIPK3-MLKL的Nets也促进了小鼠和人类ANCA相关性血管炎(AAV)的发生[17]。在脓毒症所致的AKI模型中,通过使用Nec-1可缓解肾小管上皮细胞的自噬[15]。在庆大霉素诱导的AKI模型中,MLKL表达升高,提示出现坏死性凋亡。总之,在多种因素造成AKI的模型中,都可以观察到有坏死性凋亡发生,如果可以从上游抑制坏死性凋亡,将是阻止各种疾病导致AKI的重大进展,但目前尚无针对坏死性凋亡靶向治疗AKI的药物。

2 铁死亡

铁死亡是一种由过度脂质过氧化介导的铁依赖细胞死亡方式[18],Ferrostatin-1是首个被发现的铁死亡抑制剂。谷胱甘肽过氧化物酶4(Gpx4)、FPN1、SLC7A11以及Nrf2等基因已被证明在铁死亡中发挥重要作用。然而铁死亡从基因到蛋白质再到细胞的完整途径仍不清楚。其特征可以概括为一个中心、两个特征和四个方面。其中一个中心是指脂质活性氧(ROS)的积累;两个特征是指细胞抗氧化剂的破坏和细胞内铁水平的提高,从而导致有害的脂质ROS的沉积;四个方面是铁的代谢紊乱,脂质过氧化物的积累,以及Gpx4和System-Xc的消耗(半胱氨酸/谷氨酸逆向转运蛋白系统)。铁死亡的特征不同于其他细胞死亡类型,嗜铁细胞的形态主要表现为线粒体改变,包括体积减小,膜密度增加,线粒体嵴减少,大量铁离子分布在线粒体和内质网中,但细胞膜保持其完整性,细胞核大小保持正常[19]。

2.1 铁死亡机制与调控

2.1.1 Gpx4:Gpx4是谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)家族成员,它的主要生物学作用是保护生物体免受氧化损伤。Gpx4被发现在铁死亡中起关键作用。作为一种高效的还原酶,Gpx4通过谷胱甘肽(GSH)将有毒的过氧化脂质(L-OHO)转化为无毒的脂醇(L-OH),从而抑制脂质过氧化的扩散和过氧化脂质的积累[20-21]。此外,细胞内GSH的消耗显著降低了Gpx4的活性,导致脂质过氧化和细胞铁死亡。Gpx4催化脂质过氧化还原并间接干扰Fenton反应[22],Fenton反应是维持细胞内过氧化氢(H2O2)含量的重要因素。高浓度的H2O2会产生ROS,并迅速氧化脂肪酸(FAs)和花生四烯酸(AA)产生脂毒性物质。许多研究表明,Gpx4的抗氧化功能是死亡的中心环节[23]。因此,影响Gpx4功能和活性可能会显著影响铁死亡的发生。

铁死亡抑制蛋白1(FSP1),也被称为凋亡诱导因子线粒体2,通过肉豆蔻酸结合基序被募集到质膜上[24]。它是一种不依赖Gpx4预防铁死亡的物质。它作为一种氧化还原酶来预防铁死亡,产生捕捉自由基的抗氧化剂,从而抵消脂质过氧化。然而,目前尚不清楚该系统在多大程度上与肾小管细胞中的Gpx4系统相关。

2.1.2 System-Xc途径:System-Xc是一种广泛表达于细胞膜上的氨基酸转运体,其活性亚基为SLC7A11。Cys通过System-Xc交换进入细胞内,促进GSH的合成[25]。因此,促进System-Xc的功能可抑制铁死亡。研究显示,SLC7A11调节的半胱氨酸摄取促进GSH和Gpx4蛋白的合成,最终抑制铁死亡[26]。此外,虎杖苷可以剂量依赖性地减轻System-Xc抑制剂诱导的细胞死亡[27]。另一项研究表明,下调连接蛋白43(Cx43)可以通过恢复SLC7A11水平来抑制铁死亡,从而减轻顺铂诱导的AKI[28]。一些药物,如柳氮磺胺吡啶和铁死亡诱导剂 Erastin可以通过阻断System Xc- 来诱发铁死亡[29]。

2.1.3 铁代谢、脂质过氧化:铁是人体内最重要的微量元素之一,其动态平衡对细胞的正常生理功能非常重要[30]。人体内吸收和红细胞降解产生的铁离子主要被氧化成Fe3+与转铁蛋白结合,通过Tf受体1(TFR1)形成“Tf-Fe3+-TFR1”的复合体进入细胞内,在细胞内的Fe3+进一步被还原酶STEAP3还原为二价铁并储存在铁池中[31]。当细胞中二价铁过载时,将通过Fenton反应产生过量ROS,进而启动铁死亡发生[32]。而铁蛋白可以将Fe2+转化为Fe3+储存在铁蛋白壳中,从而减少因为铁过载所导致的铁死亡。铁蛋白可分为铁蛋白轻链(FTL)和铁蛋白重链(FTH),在某些生理和病理条件下,易患铁死亡的细胞表现为TFR表达上调,铁蛋白(包括FTH1和FTL)表达下调,表明增加铁摄取或减少铁的储存形式可导致铁死亡[33]。研究表明涉及酰基辅酶a合成酶长链家族成员4(ACSL4)的脂氧合酶依赖性酶途径的激活在脂质过氧化中起关键作用,其可通过促进氧化的细胞膜磷脂的积累来驱动铁死亡。有学者通过使用CRISPR/Cas9技术,发现在铁死亡敏感的小鼠细胞中ACSL4对Erastin诱导的细胞死亡具有保护作用,认为ACSL4既是急性肾功能衰竭中体内调节细胞死亡方式的预测生物标志物,也是药效学标志物,从而为临床监测和诊断铁死亡介导性疾病提供了重要的研究价值[20]。许多亲脂性抗氧化剂(如FER-1、β-胡萝卜素、Liproxstatin-1、和α-生育酚)以及某些酶系统,包括超氧化物歧化酶、辅酶Q和GPX,可以清除多余的ROS以防止组织损伤[34]。但是目前对于铁死亡抑制剂的应用大多是动物研究,缺少临床数据,因此未来在临床上对于铁死亡相关AKI的防治仍需要进一步探讨。

2.2 铁死亡与AKI 最初,细胞凋亡被认为是AKI的主要细胞死亡类型。然而最近的研究表明,铁死亡可能是各种类型所致AKI的主要死亡途径[35],体内和体外实验表明铁死亡抑制剂对缓解肾脏损伤有效。当FTH基因敲除小鼠发生横纹肌溶解(RM)诱导的AKI时,病死率增加,表明FTH在AKI肾损伤中起重要作用。RM大鼠肾细胞胞浆和线粒体中的血红素和游离铁水平以及肾组织中的脂质过氧化水平显著增加[36]。姜黄素被发现可抑制铁死亡和有效改善RM导致的肾功能下降[37]。研究表明,缺铁可通过增加催化血红素铁来加重RM诱导的AKI,纠正缺铁可减少所有类型的AKI[38]。

IRI所致的AKI相关性铁死亡是由线粒体细胞因子肝再生增强因子(ALR)介导的,而ALR与Gpx4系统有关。沉默ALR基因会降低Gpx4活性,并促进铁死亡[39]。褪黑素和恩他卡朋被证实可上调Nrf2的核转位,导致下游SLC7A11的表达增加,并显著抑制氧化应激和铁死亡[40]。最近的研究表明,右旋糖苷可以通过抑制ACSL4减轻铁死亡诱导的AKI[41]。有关研究表明,通过抑制肌醇需要酶1(IRE1)/c-Jun NH2末端激酶(JNK)通路,可以通过抑制铁死亡来保护IRI所致的肾脏损伤[42]。Michael等发现药物抑制铁死亡可以改善严重IRI后的不良适应性肾脏反应和纤维化[43]。各种研究表明,铁络合剂和其他铁蛋白抑制剂可以减轻IRI引起的肾脏损伤,与铁死亡相关的调节因子的失活会导致或加重AKI。

高剂量的FA被广泛用于诱导动物肾脏疾病。肾脏中的高水平FA可严重损害细胞抗氧化系统,导致氧化还原失衡和氧化应激加剧。给予Fer-1可预防AKI,减轻炎性反应,表明铁死亡是FA诱导的AKI损伤的主要途径[44]。

Fer-1可显著减轻败血症导致的AKI[45]。最近的一项研究还表明,鸢尾素可增加GSH水平以及改变肾组织中Gpx4和ACSL4的表达来抑制脓毒症小鼠的铁死亡和改善肾功能[46]。褪黑素治疗已被证明通过上调Nrf2/HO-1途径抑制铁死亡和减轻脓毒症引起的AKI[47]。在庆大霉素、甘油和环孢素等药物诱导的急性肾损伤中,活性氧和过氧化氢的生成增加。同时,GSH和血红素加氧酶(HO-1)等抗氧化防御机制也发生了变化。重症急性胰腺炎(SAP)诱导的AKI后,铁蓄积,脂质过氧化增加,铁死亡相关蛋白和基因上调。Liproxstatin-1治疗可减轻SAP大鼠的胰腺和肾脏组织病理学损伤[48]。

3 结 论

目前研究已证实AKI中涉及多种形式的调控性细胞死亡,抑制其中一种细胞死亡形式可能延缓或逆转肾功能的衰竭,但这种保护作用并不全面。研究表明,对一种途径敏感的细胞可以通过另一种途径抵抗死亡,一条受调控的坏死通路可以补偿另一条途径不同的细胞死亡形式。在某些AKI病例中,铁死亡与坏死性凋亡这2条受调控的坏死途径似乎独立且平行地起作用。理想情况下,对这2条通路都有内源性抑制潜力的化合物,如NEC-1,可能是最利于治疗受这2条途径调控的AKI。同样,这样的策略也适用于其他实质脏器,如肝脏和肺。未来的研究将集中在坏死性凋亡和铁死亡的具体途径,每条途径之间的相互作用,以及其他形式的细胞死亡之间的内在联系。尽管许多动物实验表明靶向是有效的,但动物模型和人类是不同的,还需要更多的研究来证实这种策略在体内也是有效的。此外,坏死性凋亡与铁死亡能在多大程度上作为恢复AKI的治疗靶点是未来研究的重点。

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