非小细胞肺癌组织中miR-605-5p、TNFAIP3表达水平及临床意义

余凤,李良,李鸿雁,楚鑫

非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)主要起源于肺部腺体或支气管黏膜[1],其早期无明显症状,随病情进展可表现为咳嗽等临床症状,同时常因肿瘤远处转移而出现一系列并发症,此时患者可能错过最佳治疗时机,预后相对较差[2]。因此,寻找能早期评估NSCLC患者预后的指标,对NSCLC的治疗及改善患者近远期预后是非常重要的。既往研究发现[3-4],微小RNA(microRNA,miRNA)可通过与靶基因信使RNA(mRNA)3’端非翻译区结合在NSCLC细胞转移、复发等过程中起关键性作用。微小RNA-605-5p(microRNA-605-5p,miR-605-5p)是miRNA中一员,其异常表达与NSCLC发病有关[5]。肿瘤坏死因子α诱导蛋白3(tumor necrosis factor alpha induced protein 3,TNFAIP3)是内皮细胞经肿瘤坏死因子诱导后表达的编码产物,可参与炎性反应、细胞分化等过程,在多种肿瘤的恶变过程中发挥重要作用[6]。研究证实,miR-605-5p可通过靶向TNFAIP3促进NSCLC发展[7]。但二者的靶向作用尚未在临床研究中得到证实。因此,现分析NSCLC组织中miR-605-5p、TNFAIP3表达水平及其对患者预后的潜在评估价值。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2014年2月—2018年1月在东南大学附属中大医院江北院区行手术切除的NSCLC患者87例作为观察对象。术中留取NSCLC组织及距其>3 cm的癌旁正常组织,并置于液氮中保存。男47例,女40例;年龄38～75(54.19±14.82)岁,≤54岁43例,>54岁44例;吸烟52例,无吸烟35例;肿瘤直径:≤3 cm 46例,>3 cm 41例;组织类型:腺癌38例,鳞癌49例;TNM分期[8]:Ⅰ期19例,Ⅱ期36例,Ⅲ期32例;淋巴结转移37例,无淋巴结转移50例。本研究已经获得医院伦理委员会批准(ZDLS-临床2014-04),患者或家属知情同意并签署知情同意书。

1.2 病例选择标准 (1)纳入标准:①符合NSCLC诊断标准,且经病理证实[6];②临床病理资料完整;③均为首次确诊患者且配合随访。(2)排除标准:①合并其他恶性肿瘤;②入组前接受抗肿瘤治疗;③严重肝、肾功能障碍者;④合并其他肺部疾病。

1.3 观测指标与方法

1.3.1 免疫组织化学法检测TNFAIP3表达:NSCLC组织和癌旁正常组织标本经常规处理后,加入稀释的兔抗人TNFAIP3单克隆抗体(批号KL-18641,购自上海鲁汶生物科技有限公司)工作液,浓度为1∶100,其余检测方法参照即用型高效免疫组织化学二抗试剂盒(批号YS09322B,购自上海雅吉生物科技有限公司)说明书操作,其中阳性对照和阴性对照分别为已知阳性切片、磷酸盐缓冲液。由2位经验丰富的病理科医师共同对每张切片的染色结果进行判读,(1)细胞染色强度评分:无显色、弱显色、中等显色、强显色分别为0、1、2、3分;(2)阳性染色的细胞比例:<5%、5%～20%、21%～50%、51%～75%、>75%分别为0、1、2、3、4分。以两项评分的乘积<4分为TNFAIP3阴性,乘积≥4分为TNFAIP3阳性[9]。

1.3.2 实时荧光定量PCR法检测miR-605-5p、TNFAIP3 mRNA表达:取出液氮中保存的NSCLC和癌旁正常组织标本,采用Trizol试剂盒(批号HK-6013M,购自美国Invitrogen公司)提取总RNA,并依照TaqMan miRNA反转录试剂盒(批号931047,购自杭州市海基生物科技有限公司)说明书中的方法进行反转录,得到cDNA并置于-80℃冰箱保存。实时荧光定量PCR反应条件为:95℃ 10 min、95℃ 15 s、60℃ 47 s、56℃ 19 s,共运行45个循环。引物均由苏州金唯智生物科技有限公司合成,见表1。反应完成后,用2-△△Ct法分析并计算miR-605-5p、TNFAIP3 mRNA的相对表达量。

表1 miR-605-5p、TNFAIP3 mRNA引物序列Tab.1 miR-605-5p, TNFAIP3 mRNA primer sequences

1.3.3 预后随访:NSCLC患者术后第1天开始随访,随访至2023年1月31日,共随访5年。随访方式为打电话或门诊复查,随访终点为患者死亡或随访结束。无失访患者,计算总生存率。

2 结 果

2.1 NSCLC组织和癌旁正常组织中TNFAIP3表达比较 TNFAIP3主要表达于细胞浆,呈棕黄色或棕褐色颗粒,见图1。NSCLC组织中TNFAIP3阳性率为25.29%(22/87),明显低于癌旁正常组织的57.47%(50/87),差异有统计学意义(χ2/P=18.575/<0.001)。

注:红色箭头指示为TNFAIP3表达图1 NSCLC组织中TNFAIP3表达(免疫组织化学染色,×200)Fig.1 TNFAIP3 expression in NSCLC tissue (immunohistochemical staining, × 200)

2.2 NSCLC组织和癌旁正常组织中miR-605-5p、TNFAIP3 mRNA表达水平比较 NSCLC组织中miR-605-5p表达水平明显高于癌旁正常组织(P<0.01),TNFAIP3 mRNA表达水平明显低于癌旁正常组织(P<0.01),见表2。

表2 NSCLC组织和癌旁正常组织中miR-605-5p、TNFAIP3 mRNA表达水平比较Tab.2 Comparison of miR-605-5p and TNFAIP3 mRNA expression levels in NSCLC tissue and normal tissue adjacent to cancer

2.3 miR-605-5p、TNFAIP3 mRNA表达在不同临床/病理特征中差异比较 分别以NSCLC组织miR-605-5p、TNFAIP3 mRNA表达水平均值1.86、0.51为界,将患者分为miR-605-5p低表达组42例(miR-605-5p<1.86)和miR-605-5p高表达组45例(miR-605-5p≥1.86),TNFAIP3 mRNA低表达组41例(TNFAIP3 mRNA<0.51)和TNFAIP3 mRNA高表达组46例(TNFAIP3 mRNA≥0.51);NSCLC组织中miR-605-5p、TNFAIP3 mRNA表达与性别、年龄、吸烟、肿瘤直径、组织类型无关(P>0.05);miR-605-5p高表达组TNM分期中Ⅲ期、有淋巴结转移比例明显高于miR-605-5p低表达组(P<0.01);TNFAIP3 mRNA低表达组TNM分期中Ⅲ期、有淋巴结转移比例明显高于TNFAIP3 mRNA高表达组(P<0.01),见表3。

表3 NSCLC组织中miR-605-5p、TNFAIP3 mRNA在不同临床/病理特征中表达差异比较 [例(%)]Tab.3 Comparison of miR-605-5p and TNFAIP3 mRNA expression differences in different clinical/pathological features in NSCLC tissues

2.4 NSCLC组织中miR-605-5p与TNFAIP3 mRNA表达水平的相关性 NSCLC组织中miR-605-5p与TNFAIP3 mRNA表达水平呈负相关(r=-0.453,P<0.001)。

2.5 NSCLC组织中miR-605-5p、TNFAIP3 mRNA表达与患者生存的关系 NSCLC患者随访5年,生存34例(生存组),死亡53例(死亡组);miR-605-5p低表达组5年总生存率为52.38%(22/42),明显高于miR-605-5p高表达组的26.67%(12/45),差异有统计学意义(χ2=6.034,P=0.014);TNFAIP3 mRNA低表达组5年总生存率为21.95%(9/41),明显低于TNFAIP3 mRNA高表达组的54.35%(25/46),差异有统计学意义(χ2=9.557,P=0.002)。

2.6 生存组和死亡组NSCLC组织中miR-605-5p、TNFAIP3 mRNA表达水平比较 死亡组NSCLC组织中miR-605-5p表达水平明显高于生存组(P<0.05),TNFAIP3 mRNA表达水平明显低于生存组(P<0.01),见表4。

表4 生存组和死亡组NSCLC组织中miR-605-5p、TNFAIP3 mRNA表达水平比较Tab.4 Comparison of miR-605-5p and TNFAIP3 mRNA expression levels in NSCLC tissues between survival and death groups

2.7 影响NSCLC患者5年内生存的多因素分析 以NSCLC患者5年内生存情况为因变量(生存=0,死亡=1),以TNM分期(Ⅰ+Ⅱ期=0,Ⅲ期=1)、淋巴结转移(无=0,有=1)、miR-605-5p(低表达=0,高表达=1)、TNFAIP3 mRNA(高表达=0,低表达=1)为自变量,进行Logistic回归分析,结果发现,TNM Ⅲ期、有淋巴结转移、miR-605-5p高表达、TNFAIP3 mRNA低表达是影响NSCLC患者5年内生存的危险因素(P<0.01),见表5。

表5 影响NSCLC患者5年内生存的多因素Logistic回归分析Tab.5 Multivariate logistic regression analysis on the 5-year survival of NSCLC patients

2.8 NSCLC组织中miR-605-5p、TNFAIP3 mRNA表达水平对患者5年内生存的预测价值 绘制NSCLC组织中miR-605-5p、TNFAIP3 mRNA及二者联合预测患者5年内生存的ROC曲线,并计算AUC,结果显示:miR-605-5p、TNFAIP3 mRNA及二者联合预测患者5年内生存的AUC分别为0.761、0.837、0.910;二者联合的AUC高于miR-605-5p、TNFAIP3 mRNA各自单独预测的AUC(Z=2.716、1.986,P=0.007、0.047),见图2、表6。

图2 NSCLC组织中miR-605-5p、TNFAIP3 mRNA预测患者5年内生存的ROC曲线Fig.2 Receiver operating characteristic of miR-605-5p and TNFAIP3 mRNA in NSCLC tissue predicting patients' survival within 5 years

表6 NSCLC组织中miR-605-5p、TNFAIP3 mRNA表达水平对患者5年内生存的预测价值Tab.6 Predictive value of miR-605-5p and TNFAIP3 mRNA expression levels in NSCLC tissue for 5-year survival of patients

3 讨 论

miRNA是一类具有广泛生物学功能的非编码RNA,近年来研究显示其在肺癌发生发展及放化疗耐药性中均扮演着重要角色,可通过对miRNA的调控为肺癌的治疗提供新方向[10-11]。相关研究表明,miR-139-5p、miR-25-3p等在肺癌和癌旁组织中的表达存在差异[12-14]。Ye等[15]研究发现,miR-605高表达与NSCLC的发生、发展有关。但NSCLC和癌旁组织中miR-605-5p的表达是否存在差异尚不十分清楚。本研究结果发现,NSCLC组织中miR-605-5p表达水平明显高于癌旁正常组织,与Ye等[15]研究结果类似,提示miR-605-5p表达上调可能与NSCLC发病有关。进一步研究发现,miR-605-5p高表达者TNM分期Ⅲ期及有淋巴结转移比例较高,提示miR-605-5p表达变化与NSCLC恶变程度有关,可能原因是miR-605-5p高表达的NSCLC组织中癌细胞具有更强的侵袭和转移能力,可加速NSCLC进展。本研究绘制以miR-605-5p表达水平均值为界值的Kaplan-Meier生存曲线,结果显示与miR-605-5p高表达者比较,miR-605-5p低表达者具有较高的5年总生存率,提示检测miR-605-5p表达可能有利于评估NSCLC患者远期生存情况。此外,死亡患者的NSCLC组织中miR-605-5p表达水平较生存患者高,miR-605-5p高表达是影响NSCLC患者5年内生存的危险因素,且其可作为预测患者5年内生存的指标,提示miR-605-5p可能作为评估NSCLC患者生存的独立预后指标。

TNFAIP3又称为锌指蛋白A20,含7个锌指区的C和N末端区,首次发现于人脐静脉内皮细胞[16-17]。TNFAIP3作为一种核因子-κB信号通路抑制剂,其在炎性反应相关的多种恶性疾病中有重要意义[18-19]。Sharif-Askari等[20]研究报道,乳腺癌组织中TNFAIP3呈低表达,且会影响乳腺癌患者预后。秦英[21]研究发现,弥漫大B细胞淋巴瘤病灶内TNFAIP3 mRNA表达量较对照组低,其低表达与患者淋巴瘤分期有关。本研究发现,NSCLC组织中TNFAIP3阳性率、TNFAIP3 mRNA表达水平均较癌旁正常组织低,同时发现TNFAIP3低表达者TNM分期Ⅲ期及有淋巴结转移比例较高,提示TNFAIP3表达下调可能参与NSCLC发生、发展,与Sharif-Askari等[20]和秦英[21]的研究结果相似,可能原因是TNFAIP3作为癌症抑制因子,其低表达会使NSCLC细胞恶性生物学行为增强,从而加快NSCLC恶性进展。Kaplan-Meier生存曲线结果显示,TNFAIP3高表达者5年总生存率明显高于TNFAIP3低表达者,提示TNFAIP3表达可能与NSCLC患者不良预后有一定关联。同时死亡患者的NSCLC组织中TNFAIP3 mRNA表达水平明显低于生存患者,TNFAIP3 mRNA低表达是影响NSCLC患者5年内生存的危险因素,且其预测患者5年内生存的AUC为0.837,进一步提示检测TNFAIP3表达对判断NSCLC患者预后有一定价值。ROC曲线结果还显示,miR-605-5p联合TNFAIP3 mRNA预测患者5年内生存的AUC高于二者单独预测的AUC,提示联合检测miR-605-5p、TNFAIP3 mRNA表达水平,可能对判断患者5年内生存情况更有意义。此外,Pearson相关分析发现,NSCLC组织中miR-605-5p与TNFAIP3 mRNA表达呈负相关,提示miR-605-5p和TNFAIP3 mRNA可能相互影响,在NSCLC患者预后中发挥作用,但具体作用机制需深入探讨。

综上所述,miR-605-5p在NSCLC组织中表达上调,TNFAIP3 mRNA表达下调,二者呈负相关,与NSCLC患者TNM分期、淋巴结转移密切相关,均可能作为评估患者预后的重要指标,可为NSCLC的靶向治疗提供新思路。但临床影响NSCLC患者预后的因素较多,为验证结果需扩大样本继续探究。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明

余凤:设计研究方案,实施研究过程,撰写论文;李良:提出研究思路,分析试验数据,论文审核;李鸿雁:实施研究过程,资料搜集整理,论文修改;楚鑫:进行统计学分析