外泌体RNA作为胃癌诊断生物标志物的研究进展

邓柯 综述 刘琦,彭湃澜 审校

胃癌是第五大最常见的癌症,也是导致癌症死亡的第三大原因[1]。胃癌早期通常缺乏明显症状,而患者出现典型症状后往往已达到中晚期,此时患者的存活率很低,其5年存活率低于20%。而早期胃癌的5年生存率可达90%以上[2]。因此早期诊断能显著提高胃癌患者的生存率。目前早期胃癌的诊断方法仍主要是内镜检查和活检,但内镜检查有着一定的漏诊率[3-4],以及具有侵入性和组织样本有限等缺点,而肿瘤生物标志物以其安全性高及可重复采集,便于动态监测等优点,相较于内镜及活检更易被受检者接受。因此液体活检成为胃癌早期诊断的一种有前途的检测手段,故寻找特异性和敏感性均高的胃癌生物标志物对于胃癌患者早诊断有着重要意义。

1 外泌体(Exosomes)

外泌体于1983年由Pan和Johnstone等首次发现[5],是几乎所有正常细胞和肿瘤细胞分泌的一类直径在30～150 nm的膜结合双层脂质囊泡,与细胞质膜融合后从多种细胞中释放到细胞外[6],广泛分布于体液中,如血液、尿液、唾液、脑脊液、胆汁、母乳、精液等[7],其内包括蛋白质、代谢物、脂质、氨基酸、多种RNA等物质[8],外泌体RNA包括长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)、环状RNA(circular RNA,circRNA)、微小RNA(microRNA,miRNA)等[9],外泌体通过将其内容物传递到受体细胞来参与细胞间通讯,肿瘤细胞分泌的外泌体通过促进癌症增殖,抑制细胞凋亡,建立转移前的生态位,在细胞间传递信息以及调节耐药,在恶性肿瘤中起着关键作用。Liu等[10]研究发现肿瘤细胞产生的外泌体比正常细胞多约10倍,导致患者体液中外泌体的浓度显著高于正常人。传统生物标志物癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)、CA199(carbohydrate antigen 19-9)、CA724(carbohydrate antigen 724)的敏感度及特异度均较低[11-12],而外泌体作为双层脂质囊泡,可保护其转运的RNA免受核酸酶的降解,并且在各种温度和pH条件下保持稳定,因此肿瘤细胞分泌的外泌体可以较准确地反映癌症的发生及其发展变化,外泌体检测具有快速精确、采集方便、可重复采集、疼痛小、能够追踪肿瘤进展等特点[13-14],是可运用于临床的理想液体活检技术,因此外泌体作为以非侵入方式进行癌症诊断的生物标志物具有重要临床前景。

2 长链非编码RNA(lncRNA)

lncRNA是一组长度超过200个核苷酸的非编码RNA,在转录和转录后水平调控多种细胞功能,lncRNA通过基因表达调控肿瘤的发生及进展。lncRNA作为癌症生物标志物,在胃癌组织及体液中大量表达,大量研究表明循环lncRNA可作为胃癌诊断的生物标志物[15]。Cao等[16]发现lncRNA在胃癌组织中表达具有差异性,大部分的lncRNA表达上调。Xiao等[17]在进一步研究胃癌中lncRNA的表达时,检测到520个lncRNA差异表达,其中有328个表达上调,192个表达下调,且通过对差异表达的lncRNA进行层次聚类分析,结果表明差异表达的lncRNA可以准确地区分出正常组织和癌症组织。Guo等[18]研究表明总循环lncRNA-GC1几乎都包含在外泌体中,且循环外泌体lncRNA-GC1的水平与胃癌组织中表达一致。这或许提示检测胃癌患者循环中的外泌体长链非编码RNA表达水平,相对于检测胃癌组织同样具有诊断意义。Zhou等[19]计算出循环外泌体lncRNA H19的ROC曲线下面积(AUC)为0.849,高于传统的生物标志物CEA(0.721)、CA72-4(0.588)、CA199(0.640),且外泌体lncRNA H19联合以上3种传统胃癌生物标志物诊断胃癌的AUC为0.864,与单独检测外泌体lncRNA H19的AUC(0.849)并没有显著的差别。这表明外泌体lncRNA H19诊断胃癌患者的能力明显优于传统的胃癌生物标志物,意味着其可能成为未来的胃癌诊断标志物。Guo等[18]发现循环外泌体lncRNA-GC1水平与胃癌分期有显著关系,随着分期的递增lncRNA-GC1水平逐渐升高(HD与Ⅰ期,t=20.98,P<0.001;Ⅰ期与Ⅱ期,t=2.787,P=0.006;Ⅱ期与Ⅲ期,t=4.471,P<0.001;Ⅲ期与Ⅳ期,t=1.023,P=0.03),表明循环外泌体lncRNA-GC1可作为早期检测胃癌的非侵入性生物标志物,且表达水平越高暗示着患者分期达晚期的可能性越大。同样Wei等[20]计算出lncRNA NR0389785在胃癌患者体液中显著过表达其AUC为0.715,且与肿瘤的大小及TNM分期呈正相关(P<0.05)。Zheng等[21]通过实验表明胃癌患者的外泌体长链非编码RNA lnc-SLC2A12-10:1表达水平较健康对照组显著上调,且在最优临界值下外泌体lnc-SLC2A12-10:1的敏感度及特异度分别为78.3%和75.0%,患者术后的外泌体lnc-SLC2A12-10:1较术前的表达水平显著下降(P<0.05)。这意味着血液循环中的外泌体长链非编码RNA来源于胃癌患者的癌组织细胞。Xu等[22]研究发现胃癌患者血清外泌体lncRNA MIAT的表达水平显著高于胃腺瘤(P<0.001)及健康对照组(P<0.001),并且胃腺瘤患者血清外泌体lncRNA MIAT高于健康对照组(P=0.001),在胃癌患者接受治疗后,患者血清外泌体lncRNA MIAT水平显著降低(P<0.001),复发时表达水平明显升高,且高水平的患者组复发率高于低水平表达患者组。同样Xiao等[23]研究证明胃癌患者循环lncRNA CCTA1表达水平显著高于健康对照组、慢性胃炎组及非典型增生患者组,其中非典型增生组表达水平也高于健康对照组(P均<0.05)。这些都表明了外泌体长链非编码RNA在不同胃组织的不同病理阶段中表达不同,且表达量越高对于胃癌检测越有提示意义,同时表达量高的患者预后相对于表达量低的患者更差。Li等[24]实验得出胃癌患者循环中的外泌体lncRNA-GNAQ-6:1表达量显著降低,其AUC为0.732,高于CEA、CA19-9、CA72-4,但还需要更大规模的研究来确定其是否可成为胃癌患者诊断的生物标志物。Cai等[25]经实验得出与健康对照组相比,胃癌患者外泌体长链非编码RNA-psck2-2:1表达量显著下降(P=0.006),其AUC为0.896,敏感度及特异度分别为84.0%、86.5%,显著高于CA724的敏感度(56.0%)及特异度(65.5%),CA199(52.0%、62.0%)。Pang等[26]表明lncRNA-LINC00857表达下调抑制胃癌细胞增殖。Chen等[27]的研究表明lncRNA-LINC01939在胃癌患者中表达显著下调,且低表达与TNM分期、淋巴结转移呈正相关,lncRNA-LINC01939低表达与胃癌的进展及生存率低有关。表明不同类型的长链非编码RNA在胃癌患者与健康人群中体液的表达水平不同,且长链非编码RNA的显著上调及下调均意味着胃癌患者的预后相对较差。长链非编码RNA在诊断胃癌时较传统生物标志物具有更高的敏感度及特异度,因此检测胃癌患者体液中长链非编码RNA的差异表达对诊断胃癌患者具有重要的意义。

3 微小RNA(miRNA)

miRNA是一种具有17～25个核苷酸的内源性短链非编码RNA,直接通过与靶向mRNA的3’-UTR中的互补序列结合,来调节相应的mRNA降解抑或翻译,miRNA在细胞的增殖、分化、转移、凋亡等过程中起着重要的作用[28]。Ge等[29]研究表明在血清外泌体中的miRNA中有136个miRNA表达水平上调和170个miRNA表达水平下调。研究表明胃癌患者在出现临床体征或异常影像学之前,外泌体miRNA在血源性转移胃癌患者中就已经失调了[30]。Shi等[31]通过实验发现血清外泌体miR-1246表达水平增加可以区分TNM Ⅰ期胃癌患者与健康对照及良性疾病患者,AUC分别为0.843和0.811。Tang等[32]经研究得出外泌体miRNA let-7g-5p在鉴别早期胃癌与健康对照组的AUC为0.756(95%CI0.659～0.892,临界值<4.184,敏感度54%,特异度88%),明显高于CEA的AUC值(0.520,95%CI0.405～0.635,临界值<1.440,敏感度38%,特异度70%)。提示外泌体miRNA较传统生物标志物更利于胃癌的诊断。血浆外泌体miR-195-5p和miR-211-5p表达水平更高的胃癌患者预后相对于表达水平低的患者更差[33]。Zhang等[34]指出胃癌患者血清外泌体miR-215-5p表达水平较健康受试者及良性胃疾病(Benign gastric disease,BGD)患者表达水平明显升高(P<0.001),而当患者行胃切除术后血清中外泌体miR-215-5p的水平显著降低(P<0.001),而在手术患者中的ETR(early tumor recurrence)患者水平则又显著升高(P<0.001)。因此当血清外泌体miRNA在手术治疗后明显下降甚至正常,则提示预后好,而当下降后又再次升高,则可能提示复发,预后则较差。Wang等[35]研究得出血清外泌体miR-10401-3p、miR-1255b-5p、miR-6736-5p在胃癌患者组表达水平显著下降(P<0.05),miR-10401-3p 的AUC为0.833(P<0.001), miR-1255b-5p的AUC为0.832(P<0.001)、miR-6736-5p的AUC为0.814(P<0.001),证明了血清外泌体作为胃癌诊断的生物标志物的巨大潜力。Zheng等[36]的研究表明,血清外泌体miR-590-5p在胃癌患者表达水平显著降低,在健康对照组、早期(Ⅰ、Ⅱ期)、晚期(Ⅲ期)中的血清外泌体miR-590-5p表达水平分别为30.34±6.35、6.19±0.81、2.90±0.19(均P<0.05)。表明其表达水平与胃癌患者的分期呈负相关,不仅有利于胃癌患者的早期检测,还利于对胃癌患者进行病理诊断分期。相关研究表明外泌体miRNA-3184-5p可抑制胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭,但胃癌患者中的外泌体miRNA-3184-5p表达水平下调,以致于抑制胃癌细胞生长的作用减弱[37]。Jin等[38]指出胃癌患者血清外泌体miRNA-134表达水平降低,而表达低的患者的总生存期及无复发生存期较短。表明检测外泌体miRNA表达水平对于判断机体是否患有胃癌及预后具有重要临床意义。

4 环状RNA(circRNA)

环状RNA是一种非编码的共价闭环内源性RNA,于1970年由Sanger等[39]在RNA病毒中发现和鉴定,由于其没有5’帽端及3’聚(A)尾,因此对RNase R和其他核酸外切酶具有抗性而稳定存在。环状RNA主要通过作为转录调节因子、miRNA海绵以及与蛋白质相互作用而发挥其主要作用[40]。环状RNA在胃癌细胞的增殖、凋亡等过程中发挥重要的作用,因其高度稳定性及广泛分布于外泌体中,环状RNA在作为胃癌生物标志物方面具有巨大潜力[41],其中hsa_circ_0074362、hsa_circ_0000096、has_circ_0061276、has_circ_0001017、circNRIP1、cricKIAA244、circPSMC3、circ133、cricPVT1、circAKT3、circDONSON、circPVRL3等已被作为筛查胃癌的潜在生物标志物[42]。Lu等[43]发现circ-RanGAP1在胃癌组织及胃癌患者的血浆外泌体中表达量均显著上调。Shi等[44]表明胃癌组织中的circ0088300表达水平与在血浆外泌体中的表达水平相对应。同样Xie等[45]证明circSHKBP1在胃癌组织中的表达量较正常组织高2.31倍(P<0.05),胃癌患者血清中的外泌体circSHKBP1与胃癌患者肿瘤组织中的circSHKBP1水平一致,且血清中表达量约为肿瘤组织中的6倍(R2=0.679、P<0.001)。这或许表明相对于侵入性的胃癌组织活检,检测胃癌患者血清中的外泌体环状RNA对诊断胃癌具有同样的意义。Xiao等[46]通过实验研究3种外泌体环状RNA(circRNA Chr10q11、circRNA Chr7q11、circRNA1p11)在胃癌外泌体中的表达,结果显示3种外泌体环状RNA在健康受试者组、慢性胃炎组、非典型增生组、胃癌组中的表达量呈上升趋势,且各组差异均具有统计学意义,此外结果还表明,3种外泌体环状RNA在Ⅲ期+Ⅳ期的表达量均显著高于Ⅰ期+Ⅱ期(均P<0.05)。Zhang等[47]根据实验数据得出血清hsa-circ-0007507诊断胃癌的AUC值为0.832(95%CI0.771～0.892,P<0.001,敏感度73%,特异度85%),高于传统生物标志物CEA的AUC值(0.765,95%CI0.697～0.833,P<0.001)及CA199的AUC值(0.587,95%CI0.504～0.670,P=0.044),而hsa-circ-0007507分别联合CEA、CA199及三者联合的AUC为0.839、0.835、0.849,表明单独检测hsa-circ-0007507的诊断效能高于传统生物标志物,并且多种生物标志物联合检测可以弥补单一生物标志物的局限性。Zheng等[48]表明术后10 d患者外泌体hsa_circ_0015286的表达水平显著下降(P<0.01),且低表达组的患者相对于高表达组的患者总生存率长。说明监测患者手术前后的外泌体环状RNA的表达量可判断患者的预后及生存率。胃癌细胞的circ0001789表达量显著高于正常胃上皮细胞,circ0001789表达上调与胃癌的进展及预后不良有关,高表达患者存活率明显高于低表达患者[49]。Rao等[50]从鉴定出来的67 880个circRNA中筛选出1 060个表达显著不同的circRNA,其中有620个circRNA上调及440个circRNA下调。Li等[51]研究证实Hsa_circ006282在胃癌细胞和组织中低表达,其低表达后细胞增殖、抗凋亡能力增强。Zhang等[52]发现circSTAU2在胃癌患者中显著下调,然而circSTAU2的过表达在体内体外都可抑制胃癌细胞增殖、迁移和侵袭。Lu等[53]通过研究表明胃癌患者血浆Has-circ-0006848显著下调,在评估各生物标志物检测早期胃癌的诊断价值时,得出Has-circ-0006848、CEA、CA199、CA72-4表达水平的AUC分别为0.733、0.529、0.562、0.594,四者联合检测的AUC为0.825,在CEA、CA199、CA72-4表达水平均正常的早期胃癌血浆中,Has-circ-0006848诊断的AUC为0.692,表明其单独及联合传统生物标志物具有良好的诊断意义。同样有研究指出胃癌患者的血浆外泌体circRELL1表达水平下调,且与较差的分级及分期有关,而胃癌患者术后血浆外泌体circRELL1表达水平升高[54]。表明外泌环状RNA相对于传统生物标志物对筛查及诊断胃癌具有良好的诊断价值。

5 结 语

胃癌仍是世界上发病率和病死率均较高的恶性肿瘤之一,胃癌的早诊断对于患者的早治疗至关重要。近年来,液体活检作为一种非侵入性肿瘤筛查方法受到了极大的关注,检测体液中的外泌体RNA表达水平在胃癌患者的早期发现、评估分期、治疗评估、监测复发和预后评估中具有重要的意义。但目前临床上仍缺乏特异度及敏感度都较高的外泌体RNA作为生物标志物。有研究表明联合检测不同的肿瘤标志物能提高胃癌早期诊断的阳性率[55],也可以准确地判断胃癌的迁移和侵袭、预后等。因此迫切需要开发出常规的、无创的、具有高度组织器官特异性的外泌体RNA生物标志物,以早期诊断胃癌并指导治疗,提高患者的生存率及改善预后。今后对于胃癌外泌体RNA生物标志物的研究可从以下方面发展:通过大规模的临床试验寻找并且验证高特异度及高敏感度的外泌体RNA生物标志物;找到针对癌症不同病理类型的更加特异的外泌体RNA生物标志物;联合检测不同的胃癌生物标志物对胃癌进行诊断等。