慢性高眼压青光眼食蟹猴巩膜及筛板生物力学特性的变化△

吴宛蔓 贾 旭 谷 浩 陈美龄 龚 垚 沈柏宇 李 朗

青光眼是一类由多种病理因素引起的以视网膜神经节细胞进行性凋亡、特征性视神经损害和相应视野缺损为特征的视神经病变[1-3]。目前青光眼居全球不可逆致盲眼病首位[4],预测到2040年将达1.118亿人患病[5]。慢性青光眼是一种较为常见的青光眼类型,其产生的主要原因是病理性眼压(IOP)升高对筛板(LC)的机械性压迫[6]。巩膜作为眼球承受IOP的主要组织,特别是视盘周围巩膜(ppSCl)及其延伸的LC是IOP受力最集中的位置[7],其生物力学特性的变化对视神经有着重要的影响。因此,研究ppSCl和LC的生物力学特性及其在慢性高IOP作用下的变化是探索慢性青光眼发病机制的重要工作之一。本研究选取与人类高度同源的食蟹猴建立慢性高IOP青光眼模型,采用当前最先进的双轴拉伸仪和最新的生物纳米压痕仪获取各象限ppSCl和LC的力学参数,探讨慢性高IOP青光眼食蟹猴各区域生物力学特性的变化。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

选取健康雄性食蟹猴3只6眼,IOP为10～21 mmHg(1 kPa=7.5 mmHg),体重为(3.96±0.90) kg,年龄为(6.45±0.62)岁。食蟹猴由广州华珍生物有限公司提供并饲养。实验动物饲养与管理符合国家科学技术委员会的《实验动物管理条例》相关规定,本研究经贵州医科大学动物管理委员会批准(第1800132号)。食蟹猴右眼建立慢性高IOP青光眼模型(实验组),左眼为正常对照眼(对照组)。

1.2 主要试剂与仪器

硅油(德国蔡司公司),组织保存液(德国美天旎公司),裂隙灯生物显微镜(上海美沃公司),手持式眼压计(芬兰爱凯公司),眼底照相机 (重庆康华公司),OCT扫描仪(德国海德堡公司),手术显微镜(德国蔡司公司),游标卡尺(日本三丰公司),生物双轴拉伸仪BioTester5000(加拿大CellScale公司),生物纳米压痕仪(荷兰Optics11公司)等。

1.3 方法

1.3.1 食蟹猴慢性高IOP青光眼模型

食蟹猴全身麻醉,右眼前房穿刺放出适量房水(约0.2 mL)后注射适量硅油(硅油覆盖瞳孔区并超过瞳孔缘约3 mm),并动态监测IOP,当IOP大于40 mmHg时停止注射硅油。左眼不做任何处理,术后定期进行IOP、眼底照相和OCT检查(垂直杯盘比、LC形态及视网膜神经纤维层厚度)。术后IOP平稳维持并大于35 mmHg,且维持时间为1个月以上,出现LC凹陷、后退,视网膜神经纤维层变薄,垂直杯盘比大于0.6的青光眼特征改变时视为建模成功。

1.3.2 眼球直径测量与ppSCl、LC试件的制备

将食蟹猴安乐处死后,取出双眼眼球并测量其前后径和左右径,分别在上方、下方、鼻侧、颞侧4个象限距离视神经盘(ONH)中心2 mm处剪取7 mm×7 mm的ppSCl试件,在显微镜下用千分尺测量ppSCl试件的厚度;剪取5 mm×5 mm含有巩膜的视盘组织试件。将所有试件装在盛满组织保存液的离心管中。试件的获取在眼球离体8 h内完成,力学测试在离体48 h内完成。

1.3.3 生物力学试验

1.3.3.1 双轴拉伸试验ppSCl试件的安装方法

ppSCl双轴拉伸试验在双轴拉伸仪 BioTester 5000上进行,在静置条件下,4个耙片围成5 500 μm×5 500 μm的正方形,测试过程中组织浸泡在平衡盐缓冲液中,并保持恒温37 ℃。装载巩膜试件时,使巩膜横向与装置X轴对齐,轴向与装置Y轴对齐,巩膜内面(棕黑色板层)朝上。

1.3.3.2 双轴拉伸试验

弹性模量指单位应力条件下的应变值,是反映软组织材料力学特性的重要指标。用力学模型对结果进行分析:E=σ/ε,σ=F/A,A=W×h,ε=ΔL/L0,式中E为弹性模量,σ为应力,ε为应变,F为载荷,A为试件的横截面积,W为耙片的宽度,h为ppSCl组织的厚度,ΔL为试件长度的伸长量,L0为试件拉伸前的长度。

X、Y轴均设置应变为5%、10%、15%、20%的加载周期,每个应变下3个加载循环,加载与卸载时间均为20 s。实验结束后选择应变为15%的最后一个循环的数据计算出横向与轴向的应力、应变。运用Origin 9软件对应力、应变进行拟合得到的斜率作为巩膜组织的弹性模量[8]。

1.3.3.3 双轴应力松弛试验

应力松弛是保持应变恒定,弹性材料的应力随时间的延长而减小的现象。

X、Y轴终止应变均设定为15%,应力松弛时间为120 s。瞬时松弛模量由初始阶段的应力和应变计算得到,当曲线下降到达稳定时,此时的应力和应变计算得到平衡松弛模量。

1.3.3.4 双轴蠕变试验

蠕变是指弹性材料在恒定应力作用下,应变随时间的延长而逐渐增加的现象。蠕变率计算公式为:r=(ΔL2-ΔL1)/(L+ΔL1),式中r代表蠕变率;ΔL2代表蠕变结束时试件的伸长量;ΔL1代表载荷加载到设定(1 000 mN)时试件的伸长量;L代表蠕变开始时试件的长度。

X、Y轴载荷均设定为1 000 mN,蠕变时间为120 s。

1.3.3.5 纳米压痕试验

将视神经试件黏在载玻片上,视盘面朝上,滴加平衡盐缓冲液,选用球形直径为50 μm的探针,常温下测试。测试区域分别为ppSCl和LC上方、下方、鼻侧、颞侧4个象限。Optics 11数据软件对测量值进行分析,获取ppSCl和LC组织的压缩模量。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 慢性高IOP青光眼模型成功建立

造模前,实验组食蟹猴IOP[(16.33±0.58) mmHg]与对照组[(17.67±0.58) mmHg]比较差异无统计学意义(P>0.05)。造模后,实验组食蟹猴IOP[(40.22±2.40) mmHg]较对照组[(18.22±1.77) mmHg]显著升高(P<0.001)。造模后实验组食蟹猴眼底照相提示杯盘比为0.7,OCT检查显示LC凹陷、后退,视网膜神经纤维层变薄的青光眼特征改变,提示慢性高IOP青光眼模型建模成功。

2.2 眼球外径与ppSCl厚度变化

实验组食蟹猴眼球前后径[(18.42±0.12) mm]和左右径[(18.16±0.15) mm]均大于对照组[(17.01±0.11) mm、 (17.02±0.17) mm](均为P<0.05)。实验组食蟹猴ppSCl厚度[(368.7±14.12) μm]较对照组[(447.3±39.12)μm]变薄(P<0.001),实验组食蟹猴各象限ppSCl厚度均较对照组变薄(均为P<0.05)(图1)。

注:*P<0.05,**P<0.001。图1 两组食蟹猴各象限ppSCl厚度比较

2.3 双轴拉伸试验

食蟹猴ppSCl均表现出非线性,其中食蟹猴ppSCl下方象限的应力-应变曲线见图2。实验组食蟹猴下方象限ppSCl横向弹性模量大于轴向(P<0.05),实验组食蟹猴上方、鼻侧、颞侧3个象限ppSCl横向与轴向弹性模量比较差异均无统计学意义(均为P>0.05);对照组食蟹猴4个象限ppSCl横向弹性模量均大于轴向(均为P<0.05)。实验组食蟹猴ppSCl横向弹性模量、轴向弹性模量(各象限平均值)均高于对照组(均为P<0.001),实验组食蟹猴各象限ppSCl横向弹性模量、轴向弹性模量均大于对照组(均为P<0.05)(表1)。

A:实验组下方象限巩膜横向拉伸;B:对照组下方象限巩膜横向拉伸;C:实验组下方象限巩膜轴向拉伸;D:对照组下方象限巩膜轴向拉伸。图2 食蟹猴下方象限ppSCl的应力-应变曲线

表1 实验组与对照组食蟹猴ppSCl横向和轴向弹性模量

2.4 双轴应力松弛试验

食蟹猴ppSCl均表现出应力松弛现象,其中食蟹猴ppSCl下方象限的应力松弛曲线见图3。实验组食蟹猴上方、下方2个象限ppSCl横向瞬时模量,上方、下方、鼻侧3个象限ppSCl横向平衡模量均大于轴向(均为P<0.05),实验组食蟹猴鼻侧、颞侧2个象限ppSCl横向与轴向瞬时模量比较、颞侧象限ppSCl横向与轴向平衡模量比较差异均无统计学意义(均为P>0.05);对照组食蟹猴4个象限ppSCl横向瞬时模量、横向平衡模量均大于轴向(均为P<0.05)。实验组食蟹猴ppSCl横向瞬时模量和横向平衡模量、轴向瞬时模量和轴向平衡模量(各象限平均值)均大于对照组(均为P<0.001),实验组食蟹猴各象限ppSCl横向瞬时模量和横向平衡模量、轴向瞬时模量和轴向平衡模量均大于对照组(均为P<0.05)(表2)。

A:实验组下方象限巩膜横向拉伸;B:对照组下方象限巩膜横向拉伸;C:实验组下方象限巩膜轴向拉伸;D:对照组下方象限巩膜轴向拉伸。图3 食蟹猴下方象限ppSCl的应力松弛曲线

表2 实验组与对照组食蟹猴ppSCl应力松弛瞬时模量和平衡模量

2.5 蠕变试验

食蟹猴ppSCl均表现出蠕变现象,其中食蟹猴ppSCl下方象限的蠕变曲线见图4。实验组食蟹猴4个象限ppSCl横向和轴向蠕变率比较差异均无统计学意义(均为P>0.05);对照组食蟹猴4个象限ppSCl横向蠕变率均小于轴向(均为P<0.05)。实验组食蟹猴ppSCl横向和轴向蠕变率(各象限平均值)均小于对照组(均为P<0.001),实验组食蟹猴各象限ppSCl横向和轴向蠕变率均小于对照组(均为P<0.05)(表3)。

2.6 纳米压痕试验

实验组食蟹猴ppSCl压缩模量(各象限平均值)大于对照组(P<0.001),在各个象限内,实验组食蟹猴ppSCl压缩模量均大于对照组(均为P<0.05)。实验组食蟹猴LC压缩模量(各象限平均值)小于对照组(P<0.001),实验组食蟹猴各象限LC压缩模量均小于对照组(均为P<0.05)(表4)。

A:实验组下方象限巩膜横向拉伸;B:对照组下方象限巩膜横向拉伸;C:实验组下方象限巩膜轴向拉伸;D:对照组下方象限巩膜轴向拉伸。图4 食蟹猴下方象限ppSCl的蠕变曲线

表3 实验组与对照组食蟹猴ppSCl横向和轴向蠕变率

3 讨论

巩膜是一种结缔组织,胶原纤维占比最多,胶原纤维的直径、种类及在空间上的分布排列不同决定了巩膜生物力学在空间区域上具有差别。巩膜在与视神经交接处分为两层,外2/3层形成巩膜管,内 1/3 层与脉络膜形成LC,呈网状结构,视神经轴突由此穿出眼球,视盘周围的巩膜组织称为ppSCl,ppSCl、LC和巩膜管共同构成ONH的结缔组织,是青光眼生物力学的关键区域[9-10]。

3.1 慢性高IOP青光眼对眼球外径与ppSCl厚度的影响

本研究结果显示,食蟹猴慢性高IOP青光眼眼球前后径和左右径均大于正常眼。在长期高IOP的作用下,巩膜胶原纤维被动拉伸,造成眼球直径的增加。食蟹猴慢性高IOP青光眼巩膜厚度在各个象限内均小于正常眼,与前期的实验结果[11]是一致的,以往研究发现ppSCl厚度是ONH生物力学的最大决定因素,ppSCl厚度的减少将会导致LC最大应变增加,巩膜管位移增加[12]。

3.2 慢性高IOP青光眼对ppSCl生物力学特性的影响

本研究结果表明,食蟹猴巩膜组织具有非线性、各向异性和黏弹性特性,与前期的研究结果[13-15]相同。有研究表明,巩膜非线性的微观基础是卷曲的巩膜胶原纤维,随着IOP的增加巩膜胶原纤维逐渐被拉直即巩膜卷曲度逐渐变小,巩膜应变将逐渐变小[16]。正常眼球各个象限ppSCl横向弹性模量和应力松弛瞬时模量、平衡模量均大于轴向,横向蠕变率小于轴向,说明正常眼球具有各向异性,当IOP波动升高时,ppSCl横向的抵抗力比轴向的大,出现这种现象的原因可能是ppSCl的纤维组织呈横向排列且交织较前部和赤道部少[17],也可能是受后巩膜细胞密度和细胞核形态区域性差异的影响[15],这些差异或许会影响胶原纤维和细胞对机械应变的反应。本研究结果表明,与正常眼相比,食蟹猴慢性高IOP青光眼ppSCl的各向异性是降低的,这与Pijanka等[18]运用广角X射线散射分析小鼠ppSCl胶原纤维的实验结果的是一致的。长期处在高IOP下眼球巩膜的硬度是增加的,巩膜组织发生相同的应变较正常巩膜所需的应力增加。ppSCl具有黏弹性,Danford等[19]使用小角光散射分析正常人后巩膜微观结构显示,正常人后巩膜胶原纤维在外表面呈高度的线性圆周排列,而内表面的排列相对不规则,这种微观结构使巩膜外表面更坚硬以具有保护性,巩膜内表面局部变形更强以缓冲IOP波动。食蟹猴慢性高IOP青光眼ppSCl弹性及顺应性降低,在高IOP环境下,ppSCl难以通过纤维组织的弹性对高IOP进行缓冲。慢性高IOP青光眼对食蟹猴巩膜的非线性、各向异性和黏弹性特性均有明显的影响,由此可以推断,慢性高IOP青光眼患者长期的中高度IOP将使ppSCl难以通过巩膜纤维被动延伸来有效缓冲升高的IOP。

纳米压痕试验结果表明,慢性高IOP青光眼ppSCl硬度是增加的,ppSCl硬度是高IOP决定LC损伤的最重要参数[20],因此,在青光眼的高IOP病程中,LC的变形损伤不仅与直接的机械力有关系,还与ppSCl和LC构成的整体结构对IOP的反应有关。

从分子生物学角度来说,慢性高IOP青光眼巩膜硬度的增加可能与巩膜蛋白的表达改变[21]有关。巩膜糖胺聚糖(GAG)是巩膜蛋白多糖的多糖分子,带负电荷[22-23],具有亲水性,能将水分子吸到细胞外基质中,从而影响巩膜组织的水合和溶质扩散[24],GAG在巩膜黏弹性反应方面具有重要的作用,因此,GAG含量的改变可能将改变巩膜组织的黏弹性[25]。

3.3 慢性高IOP青光眼对LC生物力学特性的影响

本研究结果表明,慢性高IOP青光眼的LC出现软化,抵抗IOP的能力下降,这与Liu等[26]使用有限元模型研究的实验结果是一致的。青光眼LC软化的原因可能是青光眼患者的筛孔直径、体积减少[27],视神经轴突通过这些变形的孔径时被破坏,进而直接阻碍轴浆的运输,也有可能是局部血管受压引起的血流量减少,这样可能将损害轴浆运输的线粒体代谢。

4 结论

食蟹猴ppSCl组织具有非线性、各向异性和黏弹性特性,慢性高IOP青光眼改变了ppSCl、LC生物力学特性。正常的巩膜组织对短期异常IOP升高具有缓冲作用,减少IOP对ONH的直接压迫损伤,但青光眼患者在长期高IOP作用下,ppSCl顺应性降低、LC软化,共同造成了高IOP更容易向ONH汇集,使慢性高IOP的眼球对IOP的承受力减弱,导致ONH对IOP抵抗力降低,最终将造成ONH损伤。因此,在临床工作中应根据青光眼患者的病情病程,为患者设定个性化目标IOP,严格控制患者IOP,避免慢性高IOP改变ppSCl、LC生物力学特性。