某市29 批市售党参药材饮片高效液相色谱指纹图谱建立及化学计量学研究*

刘亮亮，孙 红，武林芝，安 琪

（山西卫生健康职业学院药学院，山西 晋中 030619）

党参始载于《本草从新》，为桔梗科植物党参Codonopsis pilosula（Franch.）Nannf.、素花党参Codonopsis pilosulaNannf.var.modesta（Nannf.）L.T.Shen 或川党参Codonopsistangshen Oliv. 的干燥根［1］，其性平、味甘，归脾、肺经，有健脾益肺、养血生津功效［2-3］。现代药理学研究表明，党参具有调节血糖、增强机体免疫力和抗胃溃疡等多种作用［4-7］。2019 年，党参被列入药食同源物质试点名单［8］，党参药材饮片需求量也大幅增加，同时对其质量规范性提出了更高要求。目前，党参药材饮片等级划分标准不统一，导致市售品质量参差不齐。2020 年版《中国药典（一部）》对其的规定仅有鉴别、检查和浸出物等项［1］，质量控制的研究多以测定其中某个或几个成分的含量为主［9-10］，高效液相色谱（HPLC）指纹图谱质量评价也主要是针对某一特定地区药材，如岭南特色饮片熟党参及其生品的研究［11］。有研究采用指纹图谱结合化学计量学实现了对党参药材及其炮制品的全面综合评价［12-13］，但缺乏对市售党参药材饮片质量的研究。中药指纹图谱为现代质量控制模式，能整体表征中药质量［14-16］。中药化学模式识别解决了中药质量多维信息的综合分析问题，能更全面地体现中药的内在品质［17-19］。鉴于此，本研究中采用HPLC 指纹图谱结合化学计量学方法（含聚类分析和主成分分析）对太原市市售不同厂家29批党参药材饮片质量进行了综合评价，现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

1260 型高效液相色谱仪（美国Agilent 公司）；1000Y 型药材粉碎机（永康市铂欧五金制品有限公司）；LK/CSJ-30型超声波清洗机（成都老肯医疗科技股份有限公司）；XPE105型电子天平、XSE204型电子天平（瑞士Mettler Toledo公司，精度分别为0.01 mg和0.1 mg）；Fresco 21型高速冷冻离心机（美国Thermo Fisher Scientific公司）。

1.2 试药

党参炔苷对照品（天津诺尔医药技术有限公司，批号1506567，含量99.21%）；党参苷Ⅰ对照品、党参炔苷宁对照品（成都克洛玛生物科技有限公司，批号分别为CHB180123，CHB200721，含量≥98%）；甲醇、乙腈、磷酸均为色谱纯，水为娃哈哈纯净水。太原市市售党参药材饮片29 批（来源信息见表1，除S5，S19，S21 样品产地为山西省外，其余样品产地均为甘肃省），经山西卫生健康职业学院杨翠玲副教授鉴定为桔梗科植物党参Codonopsis pilosula的干燥根。

表1 太原市市售29批党参药材饮片样品信息Tab.1 Information of 29 batches of commercial Codonopsis Radix Decoction Pieces in Taiyuan

2 方法与结果

2.1 指纹图谱的建立与相似度评价

2.1.1 色谱条件

色谱柱：WatersXSelect®HSST3柱（250mm×4.6mm，5µm）；流动相：0.5%磷酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱（0～20 min 时5%B → 10%B，20～70 min 时10%B →30%B，70～100 min 时30%B →60%B，100～115 min 时60%B →85%B，115～120 min 时85%B →95%B）；流速：1.0 mL/ min；检测波长：220 nm；柱温：35 ℃；进样量：10µL。

2.1.2 溶液制备

混合对照品溶液：分别取党参苷Ⅰ对照品8.77 mg，党参炔苷宁对照品8.43 mg，党参炔苷对照品9.45 mg，精密称定，置5 mL容量瓶中，分别加适量甲醇溶解并定容，摇匀，制成质量浓度分别为1.75，1.69，1.89 mg/mL的单一对照品贮备液；各精密量取适量，用50%甲醇稀释，配制成质量浓度分别为100.0，200.0，400.0µg/mL的混合对照品溶液。

供试品溶液：将样品粉碎，过3 号筛，取粉末2 g，精密称定，平行2份，置150 mL具塞锥形瓶中，加入90%甲醇30 mL，称定质量，超声（功率250 W、频率50 kHz，下同）提取30 min，取出，室温冷却，再次称定质量，用90%甲醇补足减失的质量，摇匀，取1.5 mL，置2 mL离心管中离心10 min，取上清液，经0.45µm微孔滤膜滤过，即得。

2.1.3 方法学考察

精密度试验：取供试品溶液适量，按2.1.1 项下色谱条件连续进样测定6 次，以党参炔苷峰为参照峰，记录峰面积和保留时间。结果各成分色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于3.0%（n=6），表明方法精密度良好。

稳定性试验：取供试品溶液适量，于室温下放置0，2，4，8，12，24 h时按2.1.1项下色谱条件进样测定，以党参炔苷峰为参照峰，记录峰面积和保留时间。结果各成分色谱峰相对峰面积和相对保留时间的RSD均小于3.0%（n=6），表明供试品溶液在室温下放置24 h内基本稳定。

重复性试验：取样品粉末2 g，精密称定，按2.1.2项下方法制备供试品溶液，平行6 份，按2.1.1 项下色谱条件进样测定，以党参炔苷峰为参照峰，记录峰面积和保留时间。结果各成分色谱峰相对峰面积和相对保留时间的RSD均小于3.0%（n=6），表明方法重复性良好。

2.1.4 指纹图谱建立

取29 批样品粉末，按2.1.2 项下方法制备供试品溶液，再按2.1.1项下色谱条件进样测定，记录色谱图；将色谱图数据导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版），以编号S1样品的色谱图为参照图谱，时间窗宽度设为0.1 min，采用多点校正自动匹配，采用中位数法生成对照图谱（R），建立党参药材饮片HPLC 指纹图谱的共有模式。29 批样品的叠加指纹图谱及对照指纹图谱分别见图1 和图2。共标定18 个共有峰，比对后指认出其中3个，分别为党参苷Ⅰ峰（7号峰）、党参炔苷宁峰（10 号峰）和党参炔苷峰（11 号峰）。党参炔苷为党参中主要药效成分，且峰面积较大、保留时间适中，故作为参照峰（s），将参照峰的保留时间和峰面积记为1，得各批样品色谱峰相对保留时间的RSD为0.1%～0.8%，相对峰面积的RSD为19.0%～90.3%，表明不同批次样品化学成分含量差异较大。

图1 29批党参药材饮片高效液相色谱叠加指纹图谱Fig.1 HPLC superimposed fingerprint of 29 batches of Codonopsis Radix Decoction Pieces

图2 党参药材饮片高效液相色谱对照指纹图谱Fig.2 HPLC reference fingerprint of Codonopsis Radix Decoction Pieces

2.1.5 相似度评价

采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012 版）评价29批样品的相似度，结果见表2。28批样品（S7除外）与对照指纹图谱相似度为0.853～0.974，表明太原市市售党参药材饮片一致性较好。由图1 可见，28 批样品化学成分基本一致，仅含量有差异，其中4号峰（未鉴定出）和7，10，11 号峰为含量较高的主要色谱峰。S7 样品中这4个成分的含量明显低于其他样品，是导致相似度较低的主要原因。

表2 29批党参药材饮片相似度评价结果Tab.2 Results of similarity evaluation of 29 batches of Codonopsis Radix Decoction Pieces

2.2 化学计量学分析

2.2.1 聚类分析

以18个共有峰的峰面积为变量，导入SPSS 20.0统计学软件，选择平方欧式距离测度进行聚类分析，聚类方法采用组间连接，聚类结果见图3。当分类距离为5时，29 批样品可聚为3 类，其中S4，S14，S16 - S21，S23 -S24，S27 - S29 聚为一类，S1 - S3，S5 - S6，S8 - S13，S15，S22，S25 - S26 聚为一类，S7 单独聚为一类。产地相同、厂家一致且相似度接近的样品被聚为一类，如来自河北一达药业有限公司的样品S9，S11，S22，S25，安国市广济堂药业有限公司的样品S8，S15，S26被聚为一类，从而可较好地区分质量存在差异的样品。

图3 29批党参药材饮片聚类分析树状图Fig.3 Dendrogram of cluster analysis of 29 batches of Codonopsis Radix Decoction Pieces

2.2.2 主成分分析

采用SPSS 20.0 统计学软件对29 批样品的18 个共有峰峰面积进行主成分分析，特征值与方差贡献率结果见表3，成分特征值碎石图见图4。以提取特征值大于1为原则，可得到5 个主成分因子，其累计方差贡献率达84.175%（＞80%），故可将样品的18个成分简化为5个主成分进行分析。

表3 样品共有峰峰面积主成分分析结果Tab.3 Results of PCA of common peak area of samples

为使上述提取的主成分更清晰全面地反映样品原始数据所含信息，以最大方差法对变量进行正交旋转，得到旋转后的成分矩阵（表4）。以5 个主成分因子为变量绘制载荷图（图5）。载荷的绝对值越大，对主成分的贡献越大［20］。1-4、9-11，5-8、12，1、13-14，15-16，17-18分别在主成分1，2，3，4，5上有相对较高的载荷，以29 批样品的18 个共有峰峰面积为变量，导入SIMCA 14.1 软件，采用非监督模式识别方法进行主成分分析，结果29批样品可分为3组，与聚类分析结果基本一致。

图5 主成分载荷图Fig.5 Loading plot of PCA

表4 旋转后公共因子载荷矩阵表Tab.4 Public factor loading matrix after rotation

为综合评价太原市市售党参饮片的整体质量，根据相应主成分的权重系数计算综合得分（得分越高，表明样品整体质量越好），并据此对不同批次样品质量排序［21］。详见表5 和图6。由表5 可知，不同批次样品综合得分差异较大，其中S19 样品综合得分最高，S7 样品综合得分最低。通过聚类与综合得分结果整体分析，第一类（S1等）样品质量最优，第二类（S4等）样品质量次之，第三类（S7）样品质量最差。

图6 29批党参药材饮片的主成分得分图Fig.6 PCA scoring plot of 29 batches of Codonopsis Radix Decoction Pieces

表5 29批党参药材饮片主成分得分、综合得分及排名Tab.5 Score，comprehensive score and rank of principal components in 29 batches of Codonopsis Radix Decoction Pieces

3 讨论

3.1 提取条件优化

预试验中分别以不同体积分数甲醇（100%，50%，70%，90%），乙醇（90%，100%，50%，70%）为提取溶剂，结果显示，提取溶剂为90%甲醇时，提取成分较多且主要色谱峰含量较高；对超声时间（15，30，45 min）和超声溶剂体积（15，30，45 mL）进行了考察，结果超声溶剂体积为30 mL、超声提取30 min效果较好。

3.2 色谱条件考察

预试验中对供试品溶液进行全波长扫描（190～400 nm），结果显示，在220 nm 波长处色谱峰数量较多、响应值较高且色谱峰峰形较好，故选择220 nm 为检测波长；考察了Agilent Zorbax Eclipse Plus、Agilent Zorbax StableBond和Waters XSelect®HSS T3这三类色谱柱（规格均为250 mm × 4.6 mm，5 µm），结果HSS T3 色谱柱对极性较大的化合物有相对较好的保留，且在较短的分析时间内实现目标化合物的较好分离；考察了流动相中不同添加剂（甲酸和磷酸）及其不同体积分数（0.1%磷酸、0.2%磷酸和0.5%磷酸）对色谱分离的影响，结果发现，以乙腈-0.5%磷酸水溶液为流动相时基线相对平稳，分离良好；考察了不同柱温（30，35，40 ℃）对结果的影响，结果显示，分离度随柱温升高显著改善，分析时间缩短，但柱温为40 ℃时反而影响分离度，故柱温选择35 ℃；考察了不同流速（1.0，1.2，1.5 mL/min）对结果的影响，结果发现，流速提高，分析时间缩短，但影响色谱峰分离，故选择流速为1.0 mL/min。

3.3 结果分析

本研究结果显示，太原市市售党参药材饮片化学成分一致性较好（S7 样品除外），29 批样品可聚为3 类。综合得分排序结果表明，同一产地不同厂家样品存在质量差异，同一厂家不同批次样品质量也有优劣之分。主成分分析是在尽可能保持原有数据信息的前提下，通过降维处理的方法达到简化评价指标的目的。本研究中共得到5 个主成分，其中色谱峰1 - 4、9 - 11，5-8、12，1、13-14，15-16，17-18对各个主成分的贡献较大，是导致太原市市售党参药材饮片质量差异的主要成分，峰面积较大的色谱峰4 是影响S7 样品质量的主要色谱峰之一，但色谱峰3，4，8，10，16，18 在本研究中尚未得到指认，该部分相关性研究仍需借助液质联用、核磁共振等手段进一步确认，方可作为市售党参药材饮片的质量控制指标。后续研究将建立质量控制指标含量测定方法，进一步加强党参药材饮片质量控制，以保证产品的均一性。同时，本研究中发现，产地对党参药材饮片质量优劣也有重要影响，故需扩大不同产地样本量进一步考察产地对市售党参饮片的影响，以更全面地为党参药材饮片的质量研究提供参考。

综上所述，本研究中将指纹图谱、聚类分析及主成分分析结合，可全面评价市售党参药材饮片的质量，为其质量的规范性研究提供了参考。