蓝芩口服液治疗上呼吸道感染作用机制网络药理学研究*

许昊男，王兆耀，吴慧敏，许 蕾

（1. 江苏省人民医院，江苏 南京 210029； 2. 江苏省苏州市独墅湖医院，江苏 苏州 215000； 3. 中国人民解放军东部战区总医院，江苏 南京 210002）

上呼吸道感染（URTI）是婴幼儿常见且多发的疾病，主要由病毒、细菌等感染所致鼻、咽、扁桃体等部位产生炎症，从而出现咳嗽、流涕、发烧等多种症状，易引起并发症，且传染性较强，需及时治疗［1］。临床常用治疗药物为磷酸奥司他韦，疗效较好，但患儿用药后可能出现恶心呕吐、皮肤红疹等不良反应，用药安全性欠佳［2-3］。蓝芩口服液由板蓝根、黄芩、栀子、黄柏、胖大海5 味中药组方，有清热解毒、利咽消肿功效，其不良反应较少，尤其适用于治疗婴幼儿URTI。目前，蓝芩口服液已广泛应用于治疗小儿手足口病［4］、流行性腮腺炎［5］、水痘［6］、急性扁桃体炎［7］、疱疹性咽峡炎［8］、流行性感冒（简称流感）［9-10］等URTI。但其复杂的物质基础和药物相互作用导致传统药理学的研究手段不易探寻其药效机制。鉴于此，本研究中借助网络药理学筛选蓝芩口服液的活性成分和作用靶点，探索其药效途径，分析不同组分对不同环节的作用机制，为临床治疗URTI 提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 蓝芩口服液活性成分及靶点筛选

以“板蓝根”“黄芩”“栀子”“黄柏”“胖大海”为关键词，分别检索中药系统药理学分析平台（TCMSP，http：//tcmsp-e.com/tcmsp.php）和中药综合数据库（TCMID，http：//www.megabionet.org/tcmid/），预测蓝芩口服液的活性成分及作用靶点。以口服生物利用度（OB）≥30%和类药性（DL）≥0.18 为筛选条件，保留符合条件的潜在活性成分和作用靶点。

1.2 URTI 靶点的筛选及共有靶点确定

以“upper respiratory tract infections”“upper respiratory infections”为关键词，检索GeneCards（https：//www.genecards.org/）疾病靶点数据库，预测并收集URTI 相关靶点，再将URTI 的疾病靶点与蓝芩口服液作用靶点相映射，取交集得到共有靶点（即蓝芩口服液参与治疗URTI的潜在作用靶点）。利用Uniprot（https：//www.uniprot. org/）数据库，限定物种为“Homo Sapiens”，将共有靶点的蛋白名称规范为人源的标准基因名称，作为靶点的标准化名称。

1.3 中药-成分-共有靶点-疾病相互作用网络构建

将获得的共有靶点及潜在活性成分导入Cytoscape 3.7.2 软件，绘制蓝芩口服液与URTI“中药-成分-共有靶点-疾病”网络图，以不同颜色的节点（node）分别表示药材、活性成分、靶点，成分和靶点以边（edge）相连。利用Network Analyzer工具对网络进行拓扑学性质分析，计算蛋白相互作用（PPI）网络中各节点的节点度值（degree），degree 的大小表示对应节点在网络中的关键度，依据degree降序排列，获得蓝芩口服液的核心成分。

1.4 PPI 网络构建

将获得的共有靶点上传至String 11.0 数据库（https：//www.string-db.org），设定物种为“Homosapiens”，选定interaction score ＞0.7，进行蛋白与蛋白相互作用分析，将其导入Cytoscape 3.7.2 软件进行可视化处理，并利用软件中Network Analyzer 工具计算degree 等拓扑参数，以degree 不小于所有degree 中位数的2 倍为筛选条件，确定具有重要贡献的核心靶点。

1.5 富集分析

将核心靶点通过Metascape数据库（http：//metascape.org/gp/index.html）进行基因本体论（GO）功能富集分析，通过R 包clusterProfiler 进行京都基因与基因组百科全书（KEGG）信号通路富集分析，获得蓝芩口服液对URTI 可能的作用机制通路。设定P＜0.01，并按P值从小到大排序，获取GO 功能富集分析中分子功能（MF）、细胞组成（CC）和生物过程（BP）的前10 个条目，以及KEGG 通路富集分析中的信号通路，并分别以条形图和气泡图进行可视化展示。

1.6 分子对接验证

在RCSB（https：// www. rcsb. org/）数据库中下载核心靶点的立体结构，在TCMSP 数据库中获得核心成分的立体结构。应用分子对接模拟软件AutoDock 对degree 排名前10 的核心成分和核心靶点进行受体-配体对接模拟计算，采用拉马克遗传算法进行半柔性对接，设置运行次数为50次，最大能量评价次数为2 500 000次，模拟得到最低结合能，验证二者能否较好地结合。

2 结果

2.1 蓝芩口服液的潜在活性成分和作用靶点

检索到蓝芩口服液5 味组方药材的522 个潜在活性成分和541 个作用靶点，筛选后得到119 个潜在活性成分，具体药物代谢动力学参数见表1（其中_qt 表示成分失糖苷键）。潜在活性成分中，板蓝根39 个、黄芩36 个、栀子15 个、黄柏38 个、胖大海5 个，重复成分8 个（为多个药材共有）。对蓝芩口服液中活性成分对应靶点蛋白进行标准化处理，其中板蓝根、黄芩、栀子、黄柏、胖大海对应靶点分别有104，108，177，184，35个；去重后，共得到240个靶点。

表1 潜在活性成分的药物代谢动力学参数Tab.1 Pharmacokinetics parameters of potential active ingredients

2.2 蓝芩口服液治疗URTI 的潜在靶点

去重后得到URTI 靶点7 893 个，与蓝芩口服液的作用靶点取交集，得共有靶点213 个，即为蓝芩口服液治疗URTI的潜在靶点，详见图1。

图1 蓝芩口服液对上呼吸道感染潜在作用靶点维恩图Fig.1 Venn diagram of potential targets of Lanqin Oral Liquid in the treatment of URTI

2.3 中药-成分-共有靶点-疾病相互作用网络

相应网络见图2，共包括312 个节点和1 727 条边。根据degree 降序排列前10 的成分依次为槲皮素、β-谷甾醇、豆甾醇、山柰酚、刺槐素、巴马汀、N- 甲基芸香碱、汉黄芩素、黄芩素和小檗碱，拓扑学性质见表2。

图2 中药-成分-共有靶点-疾病相互作用网络Fig.2 Interaction network of TCM-ingredients-common targets-disease

表2 蓝芩口服液核心活性成分拓扑学性质Tab.2 Topological properties of the core active ingredients of Lanqin Oral Liquid

2.4 PPI 网络

PPI 网络见图3。图中共涉及203 个节点和1 653 条边，其中节点越大degree越大，边越粗评分越高，即关系越密切，颜色由蓝变黄程度与degree 呈正相关。根据网络拓扑学参数进一步分析可见，所有节点的degree中位数为12，按条件筛选出核心靶点44个，详见图4。

图3 共有靶点的蛋白相互作用网络Fig.3 PPI network of common targets

图4 核心靶点的节点度值Fig.4 Node degree of core targets

2.5 富集分析

GO 功能富集分析结果见图5。BP 主要涉及血管生成、上皮细胞增殖、DNA 结合转录因子活性的调节、凋亡信号通路等；CC 主要涉及膜筏、囊泡内腔、RNA 聚合酶Ⅱ转录因子复合物等；MF 主要涉及细胞因子受体结合、转录因子结合、蛋白激酶结合等。

图5 GO功能富集分析结果Fig.5 Results of GO function enrichment analysis

共获得170 条重要信号通路富集结果，主要涉及白细胞介素17（IL - 17）信号通路、肿瘤坏死因子（TNF）信号通路、人巨细胞病毒感染等通路。气泡图见图6。

图6 KEGG通路富集分析结果Fig.6 Results of KEGG pathway enrichment analysis

2.6 分子对接虚拟计算结果

分子对接结果见表3。分子对接结合能越小，表明分子间结合性越好。结果显示，degree 排名前10 的核心靶点与核心活性成分均能较好地结合。

表3 蓝芩口服液核心活性成分与核心靶点分子对接结果（kJ/mol）Tab.3 Results of molecular docking between core active ingredients of Lanqin Oral Liquid and core targets（kJ/mol）

3 讨论

本研究中通过网络药理学预测了蓝芩口服液治疗URTI 的主要活性成分和潜在作用机制。根据中药-成分-共有靶点-疾病相互作用网络，槲皮素的degree最大，提示槲皮素在蓝芩口服液治疗URTI 过程中发挥关键作用。槲皮素为天然黄酮醇，同时存在于栀子和黄柏中，具有显著的抗菌、抗病毒、抗炎、抗氧化、抗肿瘤细胞增殖、免疫调节等多种药理作用［11］。有研究表明，槲皮素能通过阻断流感病毒与细胞膜上血凝素（HA2）亚基的相互作用，抑制病毒-细胞融合、干扰病毒的侵入过程等对抗流感冒病毒诱导的细胞凋亡，且其抗流感作用已经体内外实验验证［12］。黄芩中的黄芩素和汉黄芩素也能通过抑制流感病毒复制发挥抗流感作用［13］。山柰酚等具有抗炎、抗氧化、调节免疫的药理作用［14］。以上研究结论充分证实了蓝芩口服液治疗URTI的物质基础。

通过构建PPI 网络，依据degree 筛选得到核心靶点，包括AKT1，TP53，MAPK1，MAPK8，JUN，IL - 6，TNF，EGFR 等，体现了中药治疗疾病的多靶点、多通路特性。AKT1 为丝氨酸- 苏氨酸蛋白激酶，其磷酸化激活后参与调节蛋白质合成、血管生成及细胞的增殖、代谢、迁移等多种细胞过程。有研究表明，AKT1 显性阴性突变体可显著抑制病毒RNA 的表达，降低病毒衣壳蛋白表达和病毒释放［15］，而靶向PI3K/ AKT 的激酶抑制剂能显著抑制中东呼吸综合征冠状病毒的复制。IL-6和TNF 则与免疫系统稳态和炎性反应过程密切相关［16］。EGFR则在气道上皮细胞的损伤和修复过程中发挥作用［17］。可见，蓝芩口服液可通过抑制流感病毒复制、调节机体自身免疫、保护血管内皮、减轻气道损伤等机制治疗UTRI。

GO 和KEGG 富集分析结果表明，蓝芩口服液主要通过干预细胞增殖、氧化应激反应、对活性氧的反应等生物过程，以及调节细胞因子活性、受体配体活性，DNA结合转录因子等分子功能发挥作用。KEGG分析结果显示，其治疗作用涉及了IL-17 信号通路、TNF 信号通路、人巨细胞病毒感染等通路。临床研究显示，血清IL - 17 水平与流感患儿的病情进展密切相关，可作为诊断和判断预后的重要指标［18］，其介导的信号通路在机体的自身免疫及对外来病原菌的免疫过程中都发挥了重要作用［19］。TNF/NF- κB 信号通路则在机体自身的免疫调节中发挥重要作用［20］，推测蓝芩口服液可能通过抑制机体炎性反应，增强机体免疫功能，从而治疗URTI。

本研究中构建了蓝芩口服液组方中药-成分-共有靶点- 疾病的多层次网络，初步探索了其药效物质基础和作用机制，但亦有一定的局限性，如探索结果未在体内外实验、临床试验中证实所得潜在活性成分和作用机制，且活性成分仅在体内达到一定浓度才能成为药效物质，未测定活性成分的具体含量。未来将进一步完善研究内容和方法，明晰蓝芩口服液的作用机制，从而使其能更好地应用于临床。