基于网络药理学和分子对接探讨补肺温金汤防治肺尘埃沉着病的潜在作用机制*

龚享文 崔开旺 刘春云 陈 谦 黄玉梅 刘 辉

赣州市第五人民医院呼吸与危重症医学科 赣州市呼吸病防治研究所,江西省赣州市 341000

肺尘埃沉着病是由职业因素暴露,长期吸入工作中的矿物粉尘引起的以慢性肺部炎症和进行性肺纤维化为主要病理特征的全身性疾病,简称尘肺病[1]。当前临床治疗尘肺病的药物鲜少,且价格昂贵,不良反应多,患者难以承受。而中医药在治疗尘肺病中具有良好的疗效,在延缓尘肺病患者病情进展、提高生活质量和减少并发症方面具有明显优势。补肺温金汤是治疗尘肺病的经验方,由党参、陈皮、半夏、白术、茯苓、砂仁、木香、甘草八味中药组成。该方具有补肺健脾、理气化痰的功效,能够缓解尘肺病患者呼吸急促,改善肢体乏力等症状。因此,本研究通过网络药理学方法,筛选和挖掘补肺温金汤防治肺尘病的关键靶标和富集通路,并通过分子对接方法对关键因子进行验证,以期揭示补肺温金汤防治尘肺病的潜在机制,为临床治疗提供科学依据。

1 方法

1.1 补肺温金汤有效成分及对应靶点预测 在中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)中逐个搜索补肺温金汤有效成分。设置生物利用度(Oral bioavailability,OB)>30%,类药性(Drug-likeness,DL)>0.18。由于甘草成分较多,加用ADME参数:脂水分配系数(AlogP)<5、H键供体数量(Hdon)<5、H键受体数量(Hacc)<5、肠上皮通透性(Caco-2)≥-0.40。利用UniProt数据库,对补肺温金汤各个药物的成分靶点信息进行靶基因Symbol校正。在TCMSP中符合筛选标准但未检索到靶蛋白的中药有效成分,利用Pubchem数据库和Swiss Target Prediction平台,预测出其活性成分的潜在靶点。

1.2 补肺温金汤与尘肺病相关靶点预测及补肺温金汤与尘肺病共同靶点 在Gene Cards数据库、OMIM数据库、Pharm GKB数据库获得尘肺病靶点信息。使用Venny在线网站绘制韦恩图,得到补肺温金汤与尘肺病的共同靶点,作为补肺温金汤防治尘肺病的潜在靶点。

1.3 蛋白质—蛋白质互作关系网络构建 在蛋白互作平台STRING对应的程序接口输入补肺温金汤与尘肺病的共同预测靶点,设置物种为“Homo sapiens”,绘制蛋白互作关系网络图,最低相互作用评分设置为“medium confidence(0.400)”,从而得到PPI蛋白互作关系图,同时使用Cytoscape 3.7.2软件进行可视化。

1.4 补肺温金汤—成分—共同靶点网络图构建 利用Cytoscape 3.7.2软件中构建“补肺温金汤—化合物—共同靶点”网络并进行可视化分析,得到各节点的degree值。

1.5 富集分析 将补肺温金汤成分靶点与尘肺病共同靶点利用R语言进行GO富集分析和KEGG通路分析。以P<0.01为筛选条件,对排名前20的信号通路以气泡图形式展示。为进一步从信号通路角度分析补肺温金汤防治尘肺病可能的调控机制,以P<0.01、富集基因数≥6为筛选条件,并排除与尘肺病物关联的信号通路,在此基础上利用Cytoscape 3.7.2软件绘制“有效成分—靶点—通路”网络图。

1.6 分子对接 对补肺温金汤的成分与靶点进行条件筛选,将最可能发挥作用的关键成分与其对应的靶点能够完全拟合-LogQ 值最大的那条通路所对应的共同靶点,载蛋白的3D结构在PDB数据库中获得,同时化合物的2D结构信息在TCMSP数据库中获得。再使用Autodock vina软件对这些成分与靶点进行分子对接,并使用Pymol软件进行可视化作图。

2 结果

2.1 补肺温金汤活性成分及靶点预测 共得到补肺温金汤有效成分89个,药物潜在作用靶点253个,按OB值从大到小排列,前20个活性成分见表1。

表1 补肺温金汤活性成分

2.2 尘肺病靶点预测 共获得尘肺病相关基因191个。利用Venny图获得补肺温金汤药物靶点和尘肺病靶点共24个共同预测靶点。

2.3 补肺温金汤防治尘肺病的蛋白互作网络图构建 在STRING数据库获得蛋白互作信息。使用Cytoscape 3.7.2软件进行可视化(见图1),由图1可知补肺温金汤—疾病核心靶点按连接节点数由多到少依次为:IL6、TNF、PTGS2、JUN、ICAM1、CASP3、IL10、IFNG、IL2、IL4等。

图1 蛋白互作图

2.4 补肺温金汤—成分—共同靶点网络图构建 拥有交互基因的有效成分共有51个,使用Cytoscape 3.7.2软件构建补肺温金汤—成分—共同靶点网络分析图(见图2)。根据degree值,在网络中拥有最多交互基因的有效成分主要有:MOL000006(luteolin)、MOL000449(Stigmasterol)、MOL004932(glycyrrhizic acid)、MOL000358(beta-sitosterol)、MOL003896(7-Methoxy-2-methyl isoflavone)等。

2.5 GO富集分析和KEGG富集分析 24个共同靶点进行GO富集分析共1 260条目,其中生物过程(Biological process,BP)1 218条目,选出前20条(图3列出前20条,P<0.05),主要涉及对脂多糖的反应、细胞因子产生的正调控、对细菌源性分子的反应、活性氧生物合成过程、对氧化应激的反应、对抗生素的反应、活性氧反应、细胞对化学应激的反应、平滑肌细胞增殖的调控、平滑肌细胞增殖等过程。

KEGG通路共98条目,以P<0.01为筛选条件,列出前20条KEGG通路,绘制气泡图,见图4。前10条为:C-type lectin receptor signaling pathway(C型凝集素受体信号通路)、IL-17 signaling pathway(IL-17信号通路)、Inflammatory bowel disease(炎症性肠病)、T cell receptor signaling pathway(T细胞受体信号通路)、HIF-1 signaling pathway(HIF-1信号通路)、TNF signaling pathway(TNF信号通路)、Tuberculosis(肺结核)、Allograft rejection(同种异体移植排斥反应)、Malaria(疟疾)、AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications(糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路)。

图4 KEGG分析图

2.6 有效成分—靶点—通路网络图 根据补肺温金汤有效成分、共同靶点与信号通路之间的联系,构建有效成分—靶点—通路网络图,见图5。luteolin为与网络中拥有最多交互通路的有效成分,与成分—共同靶点网络图分析结果相符。

图5 补肺温金汤防治尘肺病的有效成分—靶点—通路网络图

2.7 分子对接结果 在2.4及2.6筛选出来的核心活性成分luteolin与2.3中的前两个核心靶点IL-6、TNF输入Autodock vina软件中进行半柔性分子对接。用Pymol软件进行可视化。对接结果见表2、图6。木犀草素成分与IL-6、TNF对接分数分别为-30.56、-31.39kcal/mol,木犀草素与核心靶点对接较稳定。

图6 Luteolin与IL-6、TNF分子对接图

表2 对接分数(kcal/mol)

3 讨论

中医学根据尘肺病咳、痰、喘、胸闷痛等一般临床症状,可将尘肺病归入中医学“肺痹”“肺痿”“肺胀”等范畴[2]。患者受金石之邪,邪气入肺,留滞于内,阻滞气机,肺宣降失常,日久致气、痰、湿瘀滞凝积成结节,损伤肺络,最终导致机体阴阳失衡,脏腑功能受损,病位在主要肺,病久影响脾、肾。补肺温金汤组方中党参、茯苓、白术补脾肺气,可增强机体自我修复能力;陈皮健脾燥湿、理气化痰,为治痰要药;半夏燥湿化痰、降逆止呕、消痞散结,与陈皮、茯苓合用,可增强健脾化痰之效;砂仁化湿醒脾、温中行气,为醒脾调胃要药;木香行气调中、通畅气机;炙甘草甘温,健脾补气、调和诸药;诸药合用可达补肺健脾、理气化痰之效,同时寓有培土生金之意。

如本研究所示,补肺温金汤治疗尘肺病的核心成分有89个,其中木犀草素(luteolin)、豆甾醇(Stigmasterol)、甘草酸(glycyrrhizic acid)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)、7-甲氧基-2-甲基异黄酮(7-Methoxy-2-methyl isoflavone)被确定补肺温金汤防治尘肺病的关键有效成分。已有研究表明,木犀草素、豆甾醇、甘草酸、β-谷甾醇通过调节多种因子和信号通路(如Fn-EDA、TGF-β1、TGF-β1/Smads、p38MAPK信号通路),促进肺组织自愈、平衡肺组织氧化还原反应、抑制气道局部炎症、减少胶原沉积,抑制由博来霉素或二氧化硅引起的实验性肺纤维化,抑制细胞外基质重塑,改善肺功能,从而达到改善肺纤维化的作用[3-4]。

GO富集分析和KEGG富集分析显示补肺温金汤防治尘肺病涉及C型凝集素受体信号通路、IL-17信号通路、T细胞受体信号通路、HIF-1信号通路、TNF信号通路、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路等多个通路。C型凝集素样受体(CTLR)是一种基于免疫受体酪氨酸基序的受体,通过调控基因转录和细胞因子激活,调节促进纤维化[5]。IL-17可通过激活NF-κB、JNK等多条信号通路,直接或间接地参与调控多种炎症反应及自身免疫反应性疾病[6]。AGE及其受体 (RAGE) 已被证明与肺泡稳态以及肺纤维化有关[7]。肺纤维化中AGE/RAGEs 比例升高导致肺持续纤维化以及肺上皮间质修复功能下降[8]。HIF-1信号通路、TNF信号通路对免疫炎症反应、氧化应激反应等病理生理过程具有重要的调控作用[9-10]。以上表明,补肺温金汤通过调节炎症反应以及免疫反应等信通路,发挥防治尘肺病的作用。

白细胞介素(IL-6)、肿瘤坏死因子(TNF)、前列腺素G/H合酶 2(PTGS2)、转录因子AP-1(JUN)、细胞间黏附分子1(ICAM1)、胱天蛋白酶1(CASP3)、白介素10(IL-10)、干扰素γ(IFNG)、白介素2(IL-2)、白介素4(IL-4)是PPI网络中筛选出来的关键基因。分子对接结果表明,核心成分木犀草素与IL-6、TNF、PTGS2、JUN、ICAM1对接良好,验证网络药理学对补肺温金汤防治尘肺病预测机制的准确性。近年研究发现,在尘肺病发病过程中,巨噬细胞会激活IL-6、TNF等炎症因子,诱发肺纤维化炎症反应[11]。IL-6是M2型巨噬细胞选择性激活的重要因子,可调控巨噬细胞向促炎型细胞表型的转移,诱导成纤维细胞活化[12]。TNF信号通路与肺纤维化发展过程密切相关,已有动物实验表明,在二氧化硅诱发的肺纤维化过程中,血清中TGF-β、TNF-α、FGF含量随着二氧化硅浓度的增加而增加,表明TGF-β、TNF-α、FGF是治疗肺纤维化的关键靶点[13]。JUN是IL-17信号通路的下游基因,协调细胞周期、自我更新、新陈代谢和存活等对细胞生长和增殖至关重要的基因的转录,参与炎症通路的激活。同时,JUN可阻断白细胞(CD45)、上皮细胞(CK7)和内皮细胞(CD31)的表达,增加促纤维化成纤维细胞的吞噬作用和消除对适应性免疫的抑制作用[14]。IL-10的抑制作用主要通过抑制IFN、TNF、IL-1、IL-2、IL-6和粒细胞-单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)、趋化因子等炎性细胞因子的分泌来发挥抗炎作用[15]。近年来的研究表明,IL-10在组织纤维化的作用已逐渐被知晓,如IL-10通过抑制体内和体外肺泡巨噬细胞产生的TGF-β1抑制肺纤维化的发展[16]。

综上所述,本研究从网络药理学角度阐释了补肺温金汤多成分、多靶点和多通路的调控机制。组方可能通过木犀草素、豆甾醇、甘草酸、β-谷甾醇、7-甲氧基-2-甲基异黄酮等关键成分,作用于IL6、TNF、PTGS2、JUN、IL10等多个靶点,调节免疫炎症反应、氧化应激等过程,干预C型凝集素受体信号通路、IL-17信号通路、T细胞受体信号通路等多个通路,改善尘肺病的肺纤维化损伤。