四类酒中食品添加剂检测及基质效应的研究
2023-08-26曹张欢蒋显锋黄子静孙杰
曹张欢 蒋显锋 黄子静 孙杰
现如今，酒类饮品超范围、超限量使用食品添加剂的现象屡见不鲜，如白酒中超范围或超限量使用甜蜜素、糖精钠；葡萄酒中超范围或超限量使用三氯蔗糖；果酒中超范围或超限量使用苯甲酸、合成着色剂；露酒中超范围或超限量使用甜蜜素、三氯蔗糖等。目前我国国家标准和行业标准中没有同时检测这四类酒中苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸、甜蜜素、糖精钠、安赛蜜、三氯蔗糖、柠檬黄、日落黄、苋菜红、胭脂红、亮蓝的方法标准。本文应用高效液相色谱-三重四级杆质谱技术，测定了四类酒中12种食品添加剂，探索了同时使用分子离子、特征碎片离子和保留时间作为定性依据，对多种食品添加剂进行检测的新方法。
一、材料与方法
1.材料与试剂。标准物质溶液（1000mg/mL）：苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸、糖精钠、三氯蔗糖、甜蜜素、安赛蜜、柠檬黄、日落黄、苋菜红、胭脂红、亮蓝；甲醇（99.9%，色谱纯）；乙酸铵（99.0%，macklin，色谱纯）；乙酸铵溶液（5mmol/L）：称取0.39g乙酸铵，用水溶解并稀释至1000mL，摇匀后经0.22μm水相微孔滤膜过滤备用；流动相A：甲醇+乙腈（2+1），流动相B：5mmol/L乙酸铵水溶液（含0.1%氨水）；0.22μm水相微孔滤膜。
2.仪器与设备。赛多利斯电子天平（精度：0.0001）；电热恒温水浴锅；赛默飞UltiMate3000型高效液相色谱仪，由二元泵、柱温箱、自动进样器组成；AB SCIEX API3200型三重四级杆质谱仪，配电喷雾电离源（ESI）。
3.方法。（1）色谱条件。色谱柱为AcclaimTM120 C18柱（3μm，30×100mm，赛默飞公司）；流动相A为甲醇+乙腈（2+1），流动相B为5mmol/L乙酸铵水溶液（含0.1%氨水）；柱温为40℃；进样量为30μL。
梯度洗脱条件：流速0.4mL/min。0-5min（95%流动相B），5-10min（30%流动相B），10-12min（95%流动相B），12-20min（95%流动相B）。
参考保留时间（RT）：苯甲酸（2.95min）、山梨酸（3.35min）、脱氢乙酸（2.95min）、糖精钠（3.54min）、三氯蔗糖（5.35min）、甜蜜素（4.23min）、安赛蜜（2.68min）、柠檬黄（4.24min）、日落黄（4.25min）、苋菜红（3.16min）、胭脂红（3.82min）、亮蓝（5.66min）。
（2）质谱条件。电离源：电喷雾负离子模式（ESI-）；检测方式为多反应监测（MRM）；离子化电压（IS）为-4500V；喷雾气压力（GS1）为55Psi；辅助加热气压力（GS2）为55Psi；气帘气压力（CUR）为15Psi；离子源温度（TEM）为300℃；喷撞气（CAD）：5；接口加热（ihe）：打开；其他质谱参数见表1。
（3）标准工作液的配制。称取2.5g白酒、葡萄酒、果酒、露酒阴性基质于25mL容量瓶中，根据样品中添加剂的含量情况，加入标准储备液，用初始流動相定容，使标准工作液与样液中目标峰的峰面积相近。
（4）样品处理。称取酒样2.5g，置于50mL烧杯中，于60℃水浴30min，用初始流动相洗涤残渣，并全部转移至25mL容量瓶中，定容并摇匀，经0.22μm水相微孔滤膜过滤，上液相色谱-质谱联用仪检测。
（5）条件优化。①溶剂的选择。由于检测项目涉及多种食品添加剂，前处理必须兼顾绝大多数组分的提取效率。大多数添加剂均为钠盐或钾盐，具有较好的水溶性，但实验发现摸索质谱条件时用初始流动相溶解标准物质，比用纯水溶解会大大增加几种合成着色剂的响应值。考虑到提高离子化效率，最终选择用5+95的流动相A+流动相B作为提取液。实验表明：流动相A用甲醇+乙腈（2+1），能更好地减小峰面积重复性误差；流动相B为5mmol/L乙酸铵水溶液（含0.1%氨水），可以使各组分响应值达到相对较高值。
②液相色谱条件的优化。由于检测组分多达12种，且含有胭脂红和苋菜红两种同分异构体，所以快速、高效的分离尤为重要。本实验选用了AcclaimTM120 C18柱（3μm，30×100mm，赛默飞公司）作为分析柱，以甲醇和5mmol/L乙酸铵溶液为流动相，进行梯度洗脱。结果表明，绝大多数添加剂分离良好，全部组分在6min内出峰，包括系统平衡和冲洗残留物在内，仅需20min即可完成一个样品的筛查。
③质谱参数的优化。将各添加剂标样溶液注入质谱仪，对质谱参数进行优化，以获得最佳的灵敏度和足够的子离子信息。其中，去簇电压和碰撞能量是质谱参数中最重要的2个参数。去簇电压直接影响各组分的灵敏度，随着去簇电压的升高，各添加剂的响应值逐渐增强，但去簇电压过高可能导致色素分子离子在离子源内因共振而碎裂、解离，反而影响母离子的灵敏度。经实验，在去簇电压15-70V、碰撞能量7-79eV时，绝大部分添加剂可获得较强的子离子。
④其他条件的优化。由于基质效应明显，因此选择了基质加标的方法减小基质效应。合成着色剂在做曲线时呈抛物线趋势明显，所以选择单点法配制标液。由于酒类样品中乙醇含量较高，因此应该进行除乙醇处理。
二、结果与分析
1.基质效应研究。（1）基质效应评价方法。本研究采用斜率法评价基质效应，4类酒中12种添加剂的基质效应详见表2。斜率法：ME=基质标准曲线斜率/溶剂标准曲线斜率。若 ME=1，表示不存在基质效应；ME>1（或ME-1>0），为增强效应；ME<1（或ME-1<0），为抑制效应。若0.8≤ME≤1.2，为弱基质效应；当0.5
（2）实验结果。由表2可知，检测12种添加剂时，75%以上具有中等基质效应，通过基质匹配标准曲线、同位素内标、稀释样品溶液以及优化色谱条件和采集方式，均能有效补偿12种化合物的基质效应。由于酒类食品基质复杂、同位素内标物价格昂贵且不易购买等原因，本实验采取基质匹配标准曲线以减小基质效应影响。
2.12种添加剂检测研究。（1）方法的定性、定量、检出限和定量限。进行样品测定时，若样品色谱峰的保留时间与标准品一致，并且在扣除背景后，样品谱图中各定性离子的相对丰度与浓度和同样条件下得到的标准溶液谱图相比，最大允许相对偏差符合欧盟2002/657/EC中规定的范围，则可判断样品中检出相应组分。但对于苯甲酸和山梨酸，由于在本方法的ESI－检测模式下，只产生1个二级碎片离子，无法计算碎片离子的相对丰度，因此本方法采用保留时间结合1个Q1/Q3离子对进行定性。按照方法配制混合标准溶液，在选定的HPLC-MS条件下进行测定，12种添加剂标准溶液的色谱图如图1所示，采用在空白基质中添加目标组分的方法，依据MRM色谱峰的信噪比（S/N）大于3倍确定检出限（LOD），S/N大于10倍确定最低定量限（LOQ），得到12种目标组分的LOD和LOQ，具体见表3。由表3可知，各添加剂的LOD和LOQ分别为0. 01mg/kg-0.71mg/kg和0.05mg/kg-2.37mg/kg。
（2）准确度与精密度试验。分别准确称取不含待测化合物的白酒、葡萄酒、果酒、露酒样品2.5g于25mL容量瓶中，用微量移液器准确加入一定量的各添加剂标准溶液，用初始流动相定容至刻度，混匀，配成低、中、高3个浓度水平的质量控制（QC）样品，每一浓度進行6次平行测定，结果见表4。根据表4可知，白酒、葡萄酒、果酒、露酒中低、中、高3个浓度水平的各添加剂均具有较好的准确度与精密度，
12种目标化合物在白酒中的回收率为81.3%-113.7%，相对标准偏差（RSD）为1.1%-11.2%；在葡萄酒中的回收率为80.0%-112.5%，RSD为1.2%-12.3%；在果酒中的回收率为80.2%-112.9%，RSD为1.7%-10.0%；在露酒中的回收率为80.3%-104.5%，RSD为1.4%-10.8%。
3.方法的应用。按照所建的方法对市售的23份白酒、24份葡萄酒、12份果酒、12份露酒中的12种添加剂进行测定。葡萄酒样品中，9份检出含有山梨酸，含量在0.03g/kg-0.17g/kg。果酒样品中，8份检出含有山梨酸，含量在0.01g/kg-0.19g/kg；6份样品检出含有三氯蔗糖，含量在0.01g/kg-0.22g/kg；6份样品检出含有糖精钠，含量在0.01g/kg-0.04g/kg；5份样品检出含有甜蜜素，含量在0.18g/kg-0.29g/kg；3份样品检出含有苋菜红，含量在0.01g/kg-0.03g/kg；2份样品检出含有苯甲酸，含量在0.01g/kg-0.13g/kg。露酒中4份样品检出含有山梨酸，含量在0.07g/kg-0.17g/kg；4份样品检出含有三氯蔗糖，含量在0.05g/kg-0.10g/kg；3份样品检出含有甜蜜素，含量在0.14g/kg-0.61g/kg；1份样品检出含有胭脂红，含量为0.23g/kg；1份样品检出含有苋菜红，含量为0.05g/kg；1份样品检出含有亮蓝，含量为0.01g/kg；1份样品检出含有苯甲酸，含量在0.07g/kg。
从检测结果可以看出，葡萄酒中防腐剂的检出率为38%左右；果酒中人工合成甜味剂的检出率为58%，防腐剂的检出率为75%，人工合成着色剂的检出率为25%；露酒中人工合成甜味剂的检出率为33%，防腐剂的检出率为33%，人工合成着色剂的检出率为25%。
根据GB 2760规定，所检样品的12种防腐剂、甜味剂、合成着色剂均在使用要求范围内。但需注意的是，配制酒使用复合甜味剂的现象较多，且这些甜味剂还不相同，说明市场上已存在将多种人工合成甜味剂添加到配制酒中的现象，这应引起食品安全监管部门的足够重视，以应对潜在的食品安全风险。
研究结果表明，高效液相色谱-质谱是对白酒、果酒、葡萄酒、露酒中多种食品添加剂进行检测的有效技术，具有分离效率高、定性定量结果准确的特点，应用前景广阔。
基金项目：四川省市场监督管理局科技计划项目（SCSJ2021010）。
