幽门螺杆菌对常用抗生素的耐药性及23S rRNA基因突变位点分析

赵云冬?宋顺佳?姜菲菲?王丹?赵潇颖?杨志平

摘要：目的 检测幽门螺杆菌（Hp）对5种常见抗菌药物的耐药性，指导临床合理用药。方法 收集2019年9月至2021年6月在北华大学附属医院消化内科就诊患者的胃黏膜标本165例，经13C呼气试验确诊Hp阳性，分离培养Hp。采用琼脂稀释法检测Hp对甲硝唑、克拉霉素、左氧氟沙星、阿莫西林及利福平的耐药性。提取Hp基因组DNA，PCR扩增23S rRNA基因，将PCR产物测序分析突变特征。结果 Hp药敏结果显示，165株Hp菌株对甲硝唑的耐药率最高，占90.91%（150/165），左氧氟沙星的耐药率占83.03%（137/165），克拉霉素耐药率占70.30%（116/165），阿莫西林耐药率占18.18%（30/165），利福平耐药率占16.36%（27/165）。对所有抗生素均敏感的Hp菌株占9.09%（15/165），多重耐药菌株占90.91%（150/165），其中双重耐药占28.49%（47/165），三重耐药占35.15%（58/165），四重耐药占20%（33/165），五重耐药占7.27%（12/165）。23S rRNA基因測序结果表明最常见的突变位点为A2143G，突变率为82.76%（96/116），A2142G突变率为6.03%（7/116），A2223G突变率为4.31%（5/116），但是另有8株耐药菌株未发生基因突变，占6.90%（8/116），敏感菌株均未发生基因突变。结论 Hp对克拉霉素、甲硝唑和左氧氟沙星的耐药率高，对阿莫西林和利福平的耐药率较低，23S rRNA基因突变是导致克拉霉素耐药的主要原因。

关键词：幽门螺杆菌；抗生素；耐药性；23S rRNA

中图分类号：R978.1， R446.5文献标志码：A

Resistance of Helicobacter pylori to common antibiotics and analysis of 23S rRNA gene mutation

Zhao Yun-dong1， Song Shun-jia1， Jiang Fei-fei1， Wang Dan1， Zhao Xiao-ying， and Yang Zhi-ping2

（1 Medical Technology College of Beihua University， Jilin 132013; 2 Affiliated Hospital of Beihua University， Jilin 132011）

Abstract Objective To detect the drug resistance of Helicobacter pylori （Hp） to five common antibiotics and to guide the rational use of drugs in clinic. Methods Gastric mucosal specimens of 165 patients treated in the Department of Gastroenterology， Affiliated Hospital of Beihua University from September 2019 to June 2021 were collected. Hp positive was confirmed by 13C breath test， and Hp was isolated and cultured. The drug resistance of Hp to metronidazole， clarithromycin， levofloxacin， amoxicillin， and rifampicin was detected by the Agar dilution method. Hp genomic DNA was extracted， 23S rRNA gene was amplified by PCR， and the PCR products were sequenced to analyze the mutation characteristics. Results The drug sensitivity of Hp strains showed that the resistance rates to metronidazole， levofloxacin， clarithromycin， amoxicillin， and rifampicin were 90.91% （150/165）， 83.03% （137/165）， 70.30% （116/165）， 18.18% （30/165）， and 16.36% （27/165）， respectively. Sensitivity to all antibiotics accounted for 9.09% （15/165）．Multi-drug resistant strains accounted for 90.91% （150/165）， among which double drug resistance accounted for 28.49% （47/165）， triple drug resistance accounted for 35.15% （58/165）， quadruple drug resistance accounted for 20% （33/165）， and five drug resistance accounted for 7.27% （12/165）. The results of 23S rRNA gene sequencing showed that the most common mutation site was A2143G， and the mutation rate was 82.76% （96/116）. The mutation rate of A2142G was 6.03% （7/116）， and the mutation rate of A2223G was 4.31% （5/116）. However， there were no gene mutations in eight drug-resistant strains， accounting for 6.90% of the total， and no gene mutations were found in all sensitive strains. Conclusion Hp has high resistance to clarithromycin， metronidazole， and levofloxacin， but low resistance to amoxicillin and rifampicin. 23S rRNA gene mutation is the main cause of clarithromycin resistance.

Key words Helicobacter pylori; Antibiotics; Drug resistance; 23S rRNA

幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，Hp）是革兰阴性杆菌，在人类胃中定植，Hp感染可导致胃或十二指肠溃疡、慢性胃炎，甚至胃癌或胃黏膜相关淋巴组织淋巴瘤，根除Hp可大大降低上述疾病的发病风险[1]。世界卫生组织（WHO）已将其列为Ⅰ类致癌因子[2]。据统计，全球约有50%的人口感染Hp，我国Hp的平均感染率高达55%[3]。除非接受治疗，否则Hp的定植往往会持续终生。近年来随着抗生素的大量使用，Hp的耐药率逐年升高，并且出现了较高比例的多重耐药菌株，导致Hp根除率越来越低。克拉霉素（clarithromycin，CLA）、甲硝唑（metronidazole，MTZ）、左氧氟沙星（levofloxacin，LEV）、阿莫西林（amoxicillin，AMO）、利福平（rifampicin，RFP）等是临床常用的抗菌药物。有项研究表明Hp对甲硝唑的耐药率最高，为66.8%、其次是克拉霉素和左氧氟沙星，分别为39.9%和34.5%，阿莫西林和四环素的耐药率较低，分别为6.7%和4.9%[4]。因此应根据抗生素耐药性选择合适的治疗方案，才能取得较好的疗效。本研究对Hp阳性患者的胃黏膜标本进行分离培养及鉴定，采用琼脂稀释法检测Hp对甲硝唑、克拉霉素、左氧氟沙星、阿莫西林及利福平的耐药性，并对耐药基因23S rRNA进行测序，探讨Hp耐药与基因突变之间的关系，为治疗Hp合理选择抗菌药物提供理论依据，指导临床个体化用药，有望提高其根除率。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 患者临床资料

收集2019年9月至2021年6月期间在北华大学附属医院消化内科就诊的患者胃黏膜標本。纳入标准：年龄18～80岁，性别不限；治疗前经13C-UBT（碳13尿素呼气试验）证实为Hp阳性者；经病理诊断或胃镜确诊为消化性溃疡或慢性胃炎；曾经未接受过正规治疗去根除Hp；签署知情同意书。排除标准：近1个月服用铋剂、抗生素、抑酸剂及非甾体类抗炎药者；对该研究所用药物过敏者；患心、脑、肝、肺、肾疾病及严重的全身疾病者；有幽门梗阻、急性消化道出血、胃癌及胃部切除手术史者；有精神方面疾病，未能配合检查者；孕期及哺乳期者[5]。符合纳入标准的165例Hp感染的慢性胃炎或消化性溃疡患者作为研究对象，未曾接受过根除Hp的正规治疗。

1.1.2 药品与试剂

13C-UBT检测试剂盒购自北京勃然制药有限公司；无菌脱纤维绵羊血购自青岛海博生物有限公司、Columbia Agar Base购自英国Oxoid公司；抗生素购自上海源叶生物科技有限公司。

1.1.3 仪器

恒温培养箱（上海博讯实业有限公司）；厌氧培养系统（广州市尤德生物科技有限公司）；高压蒸汽灭菌器（上海博讯实业有限公司）；TC9600-G多功能梯度PCR仪（美国Labnet公司）；JY-600C型双稳定时电泳仪（北京君意东方电泳设备有限公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 Hp培养

取胃黏膜标本经充分研磨后接种于含10%无菌脱纤维绵羊血的哥伦比亚血琼脂培养基上，于37℃微需氧环境（5% O2、10% CO2、85% N2）中培养72 h，肉眼观察菌落形态，挑选典型菌落进行革兰染色镜检，镜下为革兰阴性杆菌再分别经尿素酶试验、氧化酶试验、触酶试验确证Hp，三者均为阳性，证实为Hp，传代培养。

1.2.2 药敏试验

采用琼脂稀释法检测Hp对克拉霉素、甲硝唑、左氧氟沙星、阿莫西林及利福平的最低抑菌浓度（MIC），首先无菌条件下配置含不同抗菌药物浓度的琼脂平板，取Hp菌落研磨于0.9% NaCl溶液中，配制成6×108 CFU/mL的菌悬液，吸取2～3 μL滴加到抗生素平板上，于37℃、微需氧环境培养72 h后观察药敏试验结果。根据CLSI标准及相关文献判定耐药：克拉霉素最低抑菌浓度≥1.0 μg/mL，甲硝唑≥8.0 μg/mL，左氧氟沙星≥1.0 μg/mL，阿莫西林≥0.5 μg/mL，利福平≥4.0 μg/mL定为Hp对该药物耐药[6-7]。单一耐药指只对1种抗生素耐药，双重耐药指同时对2种抗生素耐药，三重耐药指同时对3种抗生素耐药，四重耐药指对4种抗生素同时耐药，五重耐药指对5种抗生素同时耐药。

1.2.3 PCR扩增及测序分析

从GenBank数据库中调取23S rRNA基因序列，应用DNAMAN软件设计特异性引物。引物序列：F-CCACAGCGATGTGGTCTCAG、R-CTCCATAAGAGCCAAAGCCC，扩增片段长度为425 bp。25 μL反应体系：上下游引物各1 μL，DNA模板1 μL，2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL。反应条件：94℃预变性5 min，94℃ 30 s、59℃ 30 s、72℃ 30 s，30个循环，72℃延伸10 min。取5 μL PCR产物于1.2%琼脂糖凝胶电泳，用凝胶电泳成像系统拍照观察。将PCR产物送往生工测序。应用 DNAMAN 8.0和MEGA-X 5.1分子生物学软件分析23S rRNA基因核苷酸序列突变形式。

2 结果

2.1 鉴定Hp

将Hp菌株培养3～5 d 后，哥伦比亚血平板上长满灰白色、针尖样、小菌落，革兰染色后镜下可见典型的呈S形、螺旋状的革兰阴性杆菌，尿素酶试验、氧化酶试验、触酶试验结果均阳性，证明为Hp菌株（图1）。

2.2 Hp对5种抗生素耐药情况

165株Hp菌株克拉霉素、甲硝唑、左氧氟沙星、阿莫西林和利福平表现不同程度的耐药性，对克拉霉素、甲硝唑、左氧氟沙星的耐药率较高，对阿莫西林和利福平的耐药率较低，阿莫西林仍可作为根除Hp的一线抗菌药物（表1）。

2.3 Hp多重耐药情况

165株Hp菌株对所有抗生素均敏感的仅有15株（占9.09%），多重耐药菌株150株（占90.91%），其中双重耐药47株（占28.49%），三重耐药58株（占35.15%），四重耐药33株（占20%），五重耐药12株（占7.27%），见表2。

2.4 测序结果分析

116株克拉霉素耐药菌株中，108株23S rRNA基因发生突变，突变率为93.10%，最常见的突变位点为A2143G，突变率为82.76%（96/116），A2142G突变率为6.03%（7/116），A2223G突变率为4.31%（5/116），但是另有8株耐药菌株未发生基因突变，占6.90%（8/116），敏感菌株中均未发现基因突变。

3 讨论

Hp是一种螺旋状、有鞭毛的革兰阴性致病菌，定植于黏液层，也附着在分泌黏液的胃上皮细胞表面。感染Hp可导致一些胃肠道疾病，例如慢性胃炎、胃黏膜相关淋巴组织淋巴瘤、消化性溃疡以及肠化生。根除Hp可降低消化性溃疡的复发，缓解早期胃MALT淋巴瘤，同时预防胃癌的发生发展[8]。Hp感染的根除治疗一直是胃肠病领域的研究热点之一，近年来，随着临床上抗生素的广泛使用，Hp的耐药率日渐增长，Hp对抗菌药物产生耐药性是导致其根除治疗失败的主要原因，因此了解Hp对抗生素的耐药现状对于指导临床个体化用药，选择最佳治疗方案，提高Hp根除疗效具有重要意义。

标准三联疗法的根除率低于80%，因此不推荐作为Hp的一线根除疗法[9]。目前由“质子泵抑制剂+两种抗生素+铋剂”组成的四联疗法作为根除Hp的一线治疗方案，克拉霉素、甲硝唑、阿莫西林、左氧氟沙星及四环素是临床常用的备选抗菌药物[10-11]。随着抗菌药物的不合理使用，Hp对抗生素的耐药性逐年上升，并且出现越來越多的多重耐药菌株，导致Hp的根除率越来越低。王松研究显示武汉地区Hp对甲硝唑的耐药率占43.45%，克拉霉素耐药率占21.74%，阿莫西林耐药率较低占13.04%[12]。周雄杰研究显示Hp对甲硝唑、克拉霉素和左氧氟沙星耐药率较高，分别为87.8%、49.7%和48.5%，对阿莫西林和四环素耐药率较低，分别占8.7%和11.6%[13]。本研究结果显示甲硝唑的耐药率为90.91%（150/165），左氧氟沙星的耐药率为83.03%（137/165），克拉霉素耐药率为70.3%（116/165），阿莫西林耐药率为18.18%（30/165），利福平耐药率为16.36%（27/165）。并且出现了不同程度的多重耐药性，其中双重耐药47株（占28.49%），三重耐药58株（占35.15%），四重耐药33株（占20%），五重耐药12株（占7.27%）。最常见的耐药模式是克拉霉素、甲硝唑和喹诺酮类药物的三重耐药。Hp的耐药性因药物和地理区域的不同而不同[14]。文婷婷等[15]研究结果显示昆山地区Hp多重耐药菌株占56.86%。赵平等[16]研究显示西安地区多重耐药菌株占34.71%，其中双重耐药占24.79%。不断增加的抗生素多重耐药性是成功控制Hp感染的重大挑战，在中国发现了三重、四重和五重甚至六重耐药菌株，这突显了快速测定药物敏感性对提高Hp根除成功率的必要性，若在治疗前进行药敏试验可指导临床合理选择抗生素，提高Hp根除成功率。

23S rRNA基因V区发生突变是导致Hp对克拉霉素产生耐药性的主要机制，其中A2143G、A2142G和A2142C是最常见的突变位点[17]。本研究结果显示A2143G突变率最高，占82.76%（96/116），A2142G突变率占6.03%（7/116），A2223G突变率占4.31%（5/116），但是另有8株耐药菌株未发生基因突变，提示可能存在其他因素导致了克拉霉素的耐药，安莹研究结果表明敲除外排泵基因hefA、hefD和hefG能增加Hp对克拉霉素的敏感性，并且逆转一些耐药菌株对克拉霉素的耐药性[18]。

本研究检测了Hp对甲硝唑、克拉霉素、左氧氟沙星、阿莫西林及利福平的耐药性，其中克拉霉素、甲硝唑和左氧氟沙星的耐药率较高，利福平和阿莫西林的耐药率相比较低。通过相关耐药基因测序结果发现23S rRNA基因与克拉霉素的耐药性相关。检测Hp对抗生素的耐药情况，对于制定合适的抗菌药物组合方案，指导临床合理用药具有重要意义。

参 考 文 献

Graham D Y. Helicobacter pylori update： Gastric cancer， reliable therapy， and possible benefits[J]. Gastroenterology， 2015， 148（4）： 719-731.

宋函憶， 姚鑫洁， 郑宇芪， 等. 幽门螺杆菌药敏检测方法比较及个体化治疗200例临床分析[J]. 中国实用内科杂志， 2019， 39（9）： 813-816.

项利娟， 朱新建， 黄德富， 等. 幽门螺杆菌感染调查与耐药性分析[J]. 中华医院感染学杂志， 2015， 25（8）： 1710-1711， 1727.

Zhang Y X， Zhou L Y， Song Z Q， et al. Primary antibiotic resistance of Helicobacter pylori strains isolated from patients with dyspeptic symptoms in Beijing： A prospective serial study[J]. World J Gastroenterol， 2015， 21（9）： 2786-2792.

杨志平， 王海铭， 关晓辉， 等. 幽门螺杆菌胃内负荷与毒力亚型抗体对幽门螺杆菌根除治疗的临床意义[J]. 中国免疫学杂志， 2021， 37（14）： 1761-1763.

庄少华， 付金金， 饶君. 炎症性肠病患者幽门螺杆菌感染情况及耐药性分析[J]. 中华医院感染学杂志， 2020， 30（7）： 1016-1020.

Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance standards for antimocrobial susceptibility testing： Twenty-second informational supplement[S]. M100-S23， CLSI， 2013.

孙婷， 陈泽鑫， 李鹏， 等. 幽门螺杆菌耐药性及三种耐药检测方法的比较[J]. 世界华人消化杂志， 2018， 26（18）： 1111-1118.

Graham D Y， Fischbach L. Helicobacter pylori treatment in the era of increasing antibiotic resistance[J]. Gut， 2010， 59（8）： 1143-1153.

Lim S G， Park R W， Shin S J， et al. The relationship between the failure to eradicate Helicobacter pylori and previous antibiotics use[J]. Dig Liver Dis， 2016， 48（4）： 385-390.

刘文忠， 谢勇， 陆红， 等. 第五次全国幽门螺杆菌感染处理共识报告[J].中国实用内科杂志， 2017， 37（6）： 509-524.

王松， 肖丹， 张小红， 等. 600例消化性溃疡患者幽门螺杆菌感染状况、耐药性及感染危险因素分析[J]. 中国病原生物学杂志， 2019， 14（7）： 837-839.

周雄杰， 吕志刚， 柳家红， 等. 幽门螺杆菌感染患者影响因素及耐药性分析[J]. 中华医院感染学杂志， 2018， 28（16）： 2490-2493.

Lee J H， Ahn J Y， Choi K D， et al. Nationwide antibiotic resistance mapping of Helicobacter pylori in Korea： A prospective multicenter study[J]. Helicobacter， 2019， 24（4）： e12592.

文婷婷， 杨勇， 戴娜， 等. 151例幽门螺杆菌检测阳性患者对不同抗菌药物的耐药及多重耐药情况分析[J]. 抗感染药学， 2020， 17（7）： 982-983.

赵平， 柏凡， 龚均， 等. 胃十二指肠疾病幽门螺杆菌感染及抗生素耐药状况分析[J]. 现代消化及介入诊疗， 2020， 25（12）：1591-1595.

Alavifard H， Mirzaei N， Yadegar A， et al. Investigation of clarithromycin resistance-associated mutations and virulence genotypes of Helicobacter pylori isolated from iranian population： A cross-sectional study[J]. Curr Microbiol， 2021， 78（1）： 244-254.

安瑩. 幽门螺杆菌AcrAB-TolC外排泵相关基因hefA/D/G在克拉霉素耐药中的作用[D]. 南昌： 南昌大学， 2019.