基于高分辨质谱的darobactin的结构解析策略

张含智?田振华?罗煜?秦东光?郭锋

摘要：目的 Darobactin（达罗巴汀）是一类经核糖体合成的翻译后修饰肽，该七肽具有独特的稠和双环结构，本研究建立了系统的基于高分辨质谱的darobactin组分的结构解析策略。方法 依据文献中报道的在高能碰撞裂解（HCD）和碰撞诱导裂解（CID）模式下获得的一级及二级高分辨质谱数据，以碎片离子结构式的方式呈现了darobactin A的裂解途径，并修正了文献中部分碎片离子结构和质荷比的错误。针对特殊的双环结构，本文提出了基于生物合成路径的“逆向裂解途径”来确证1位和3位色氨酸之间因醚键断裂而生成的特征离子，并首次解析出包含特殊碳碳键的色氨酸-赖氨酸的碎片离子，为判断5位色氨酸被其他氨基酸（如精氨酸）取代提供了直接證据。结果 建立了系统的darobactin A的结构解析策略，并以darobactin B/D/E的碎片离子加以验证，从理论上推导了其他darobacitn组分如C和F的特征离子。结论 本文为快速判定darobactin新组分及其前体肽的结构提供了研究基础。

关键词：Darobactin A；双环七肽；高分辨质谱；结构解析策略；逆向裂解途径

中图分类号：R978.1文献标志码：A

Structural analysis strategy of darobactins based on high resolution

mass spectrometry

Zhang Han-zhi， Tian Zhen-hua， Luo Yu， Qin Dong-guang， and Guo Feng

（Abiochem Biotechnology Co.， Ltd， Shanghai 200241）

Abstract    Objective Darobactin， which is a heptapeptide with unique condensed and bicyclic scaffold， belongs to a class of post-translational modified peptide synthesized by ribosome. In this study， a systematic structure analysis strategy for darobactin components based on high-resolution mass spectrometry was established. Methods Based on the m/z of adduct ions and fragment ions obtained in HCD and CID modes reported in the literature， a systematic structural analysis strategy based on high-resolution tandem mass spectrometry was established. The fragmentation pathway of darobactin A is presented in the form of fragment ions' structures. The errors in the structure and m/z of some fragment ions in the literature were corrected. It is proposed an idea of “reversed fragmentation pathway” based on the biosynthetic pathway to confirm the characteristic ions formed by the C-O-C bond breaking between tryptophan1 and tryptophan3 of the special bicyclic scaffold. Besides， the fragment ions of tryptophan3-lysine5 residue containing special C-C bond were characterized for the first time， providing direct evidence for judging whether tryptophan5 is replaced by other amino acids （such as arginine）. Results The established structural analysis strategy can be reasonably used to determine the structure of known darobactin components （such as B/D/E）， and can predict the fragment ions of homologous components （such as darobactin C/F， no MS/MS is given in the references）. Conclusion This study provides a resolution for rapid determination of the structure of new components of darobactin and its precursor peptides.

Key words Darobactin A; Bicyclic heptapeptide; High resolution MS/MS; Structural analysis strategy; Reversed fragmentation pathway

多重耐药性的出现是全球公共卫生面临的主要威胁之一，2017年，世界卫生组织公布了一份耐药菌清单，其中耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌和肠杆菌属等革兰阴性菌被确定为“I级优先”要被迫切解决的病原菌[1]。针对如上病原菌感染，多黏菌素B/E具有较好的临床治疗效果，在一定程度上被称为“最后一道防线”，然而随着该类药物的使用量加大，也出现了耐药菌[2]。发现新型抗生素来应对耐药菌危机迫在眉睫，基于对细菌基因组和天然产物生物合成基因簇的了解不断增加，挖掘尚未被利用的天然菌群可能是寻找具有新型骨架和作用模式的抗生素的一个富有成效的策略[3]。美国东北大学Kim Lewis团队[3]在线虫共生菌Photorhabdus khanii分离株中发现了一种新型抗生素darobactin（达罗巴汀），darobactin属于核糖体合成的翻译后修饰肽，主要组分darobactin A的氨基酸序列为色氨酸1（Trp）-天冬酰胺2（Asn）-色氨酸3-丝氨酸4（Ser）-赖氨酸5（Lys）-丝氨酸6-苯丙氨酸7（Phe），结构式见图1所示，氨基酸之间除了以常见的酰胺键连接之外，还具有独特的稠和双环结构。Darobactin A的Trp1吲哚环7位与Trp3-β位碳之间形成醚（C-O-C）键，Trp3吲哚环6位与Lys5-β碳之间形成碳碳（C-C）键，Trp3–Lys5之间非活化位点的C-C键是比较罕见的[4]。张琪等[5]通过H218O插入实验发现和验证了DarE这种S-腺苷甲硫氨酸酶（rSAM）经自由基历程催化形成了C-O-C键及C-C键。Darobactin A具有优异的抗菌活性，对大肠埃希菌、铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌等一系列革兰阴性菌（包括多黏菌素、碳青霉烯和β-内酰胺的耐药菌）均展示出强力的抗菌活性（MIC=2 mg/mL）[4]。这是因为darobactin具有全新的作用机制，以细菌外膜的插入酶（insertase）BamA为靶点，双环骨架采用刚性β-链构象与BamA结合，破坏细菌外膜诱导细胞裂解，最终导致细菌死亡[6]。

在darobactin A的结构确认中，Lewis等[4]从发酵液中经阳离子交换色谱纯化了darobactin A，采用高分辨质谱并通过高能碰撞裂解串联质谱（HCD-MS/MS）获得了darobactin A的分子量和二级碎片离子，但并未对特征离子（特别是双环部分的离子）进行归属，主要通过氢谱、碳谱、H-C相关谱及COSY谱、ROESY谱确定了其结构，经ROESY谱确定了Trp3-β位碳为R构型，Lys5-β位碳为S构型。除darobactin A外，Lewis等[4]还在Photorhabdus菌中发现了darobactin B（4位为苏氨酸，Thr；6位为精氨酸，Arg），在Yersinia菌中发现了darobacitn C（2位为Ser，5位为Arg）/D（5位为Arg）/E（2位为Ser），它们之间具有较高序列同源性，结构式见图1，与darobactin A有区别的氨基酸残基以红颜色标示。张琪等[5]对darobactin A前体肽DarApk（43-58）-1、darobactin D前体肽DarAyi（55-66）-1的b/y离子进行了解析，但并未解析双环部分的特征离子，而是以（b/y+12 Da）代表形成了双环结构。B?hringer等[7]又通过异源表达的途径产生了darobactin F[2位为Lys，6位为Asn，7位为亮氨酸（Leu）]，以碰撞诱导裂解（CID）获得了darobactin A/B/D/E的串联质谱数据，并以折线断键的方式在如上组分的结构式上对碎片离子进行了归属，但由于darobactin独特的双环结构，这种方式并不直观，且存在误判碎片离子结构的风险；另外与Lewis等[4]的结果比较，其特征离子较少，如未获得关键性的Trp3-Lys5碎片离子。高分辨串联质谱可以提供详细、准确的结构信息，在同源多肽类化合物的结构鉴定中发挥了重要作用[8]。假设能对双环部分的特征离子进行确认，那么对于darobactin A及其同源化合物的结构确认将起到事半功倍的效果。

本实验室在前期建立了基于高效液相色谱-高分辨串联质谱的多肽类抗生素的结构解析策略，已成功解析了不饱和多黏菌素、磺酸化杆菌肽、共轭双键化替考拉宁等多个新组分，这种解析思路同样适用于darobactin组分的结构分析[9-11]。但darobactin具有的特异性的双环结构又使得对其结构解析具有很大的挑战。由于无法得到darobactin的实际样本，本文参考Lewis[4]和B?hringer等[7]的MS/MS圖，借鉴自由基关环的生物合成路径，提出了“逆向裂解途径”的解析机理，合理解析了双环部分的特征离子，建立了一级及二级高分辨质谱数据的系统的darobactin A的结构解析策略，并以B/D/E的碎片离子加以验证，从理论上推导了其他darobacitn组分如C和F的特征离子。本文为快速判定darobactin新组分及其前体肽的结构提供了研究基础。

1 仪器与试药

由于在国内尚未收集到darobactin组分，本文综合依据Lewis[4]和B?hringer等[7]提供的darobactin组分的MS/MS图建立结构解析策略，前者选择的仪器为配有电喷雾（ESI）离子源的Q Exactive Hybrid Quadrupole 质谱仪（美国Thermo Scientific公司），后者使用的仪器为1290 UPLC（美国Agilent公司）-microOTOFQ 质谱仪（德国Bruker Daltonics公司）。

Darobactin A由Photorhabdus khanii菌发酵产生并经XAD16N树脂、阳离子交换色谱纯化得到[4]。B?hringer等[7]在大肠埃希菌中异源表达产生了darobactin A-F组分，并经反相色谱或快速柱色谱（flash chromatography）分别纯化了darobactin A/B和D/E组分，并给出了以上4种组分的MS/MS谱图。

2 方法

2.1 仪器方法

根据文献[4]描述，darobactin A溶于含有0.1%甲酸的水溶液中，直接进样流速为5 mL/min；质谱选择正离子扫描模式，喷雾电压为1.50 kV，喷雾电流为50 μA，毛细管温度为125℃，不使用鞘气，辅助气设置为2；MS/MS采用HCD模式，碰撞能量为55 eV。

根据文献[7]描述，色谱柱为Acquity UPLC BEH C18柱（1.7 mm，2.1 mm×100 mm），柱温设置为45℃，流动相A：含0.1%甲酸的水溶液，流动相B：含0.1%甲酸的乙腈溶液，流速为0.6 mL/min，梯度洗脱条件：0 min： 95%A; 0.80 min： 95%A; 18.70 min： 4.75%A; 18.80 min： 0%A; 23.00 min： 0%A; 23.10 min： 95%A; 25.00 min： 95%A。质谱选择正离子扫描模式，MS采集范围m/z 100～1500，Auto MS/MS采用CID模式，在m/z 100～1000范围内，双电荷离子碰撞能量设置为15～32 eV，单电荷离子碰撞能量设置为18～45 eV。

2.2 结构解析策略

Lewis等[4]提供了darobactin A在HCD模式下的实测值（observed adduct ions）如下：单/双电荷离子峰分别为m/z 966.4105 [M+H]+、m/z 483.7086 [M+2H]2+，与理论计算值（calculated adduct ion，m/z 966.4104[M+H]+，m/z 483.7089 [M+2H]2+基本一致，见表1。Darobactin B-F未提供实测值，它们的单/双电荷离子峰（理论计算值）均展示在表1中[7]，其中双电荷离子分别为m/z 525.2512、m/z 484.2065、m/z 497.7119、m/z

470.2034和m/z 487.2482 [M+2H]2+。由于Lewis[4]和B?hringer等[7]分别采用了HCD和CID两种碎裂方式，darobactin组分的特征离子见表1所示，两种裂解方式得到的碎片离子并不完全一致，可以相互验证和补充；Lewis未放大低m/z区间（小于200）的图谱，故低端m/z信息量较少。从表1中可以看出，HCD得到更丰富的碎片离子信息，以此为基础并辅以CID获得的低端m/z确定了darobactin A的裂解规律。B?hringer等[7]还给出了darobactin B/D/E的MS/MS图，验证了如上裂解规律的正确性，并为预测darobactin C和F的碎片离子提供了依据。

综合以上信息，建立darobactin组分的结构解析策略：①获得darobactin组分的高分辨一级质谱实测值，若与已知组分的分子量相同，且与理论计算数值（可通过结构式画图软件获得该数值，如KingDraw 软件）相同，可初步判断为该已知组分或其同分异构体。②获得darobactin组分的二级质谱图，无论一级质谱数据是否与已知组分相同，均可与darobactin A裂解途径中的特征碎片离子进行比较，判断哪个位点的氨基酸发生改变。如通过y2、y1离子确定侧链结构；通过b2、b1、a1、（y5-y2）及其脱NH3、脱CO或脱H2O等离子确认双环部分的结构；特别是Trp3-Lys5（darobactin A）的特征离子如m/z 228.1595可用于判断5位氨基酸。需注意的是，碎片离子的实测值与理论值应基本一致，如文献[7]中，误差小于2 ppm。③结合darobactin组分的生物合成路径，生成Trp1和Trp3之间的醚键经历了双键化Trp3的中间体过程，则在二级质谱碎裂过程中可经历“逆向裂解途径”也会产生具有双键Trp3的特征离子。④结合一级、二级高分辨质谱数据，并与理论计算数值比较，共同确定darobactin组分的结构。

3 结果与讨论

3.1 Darobactin A的结构解析策略

通过比较Lewis[4]和B?hringer等[7]提供的darobactin A碎片离子的实验m/z数值和理论m/z数值，见表1，两组数据是基本吻合的，误差在0.1～1.8 ppm范围内，本文采用碎片离子的理论m/z数值来建立结构解析策略。归属线性多肽的碎片离子时，经常采用折线断键的方式标示b/y离子[5]，但这种方式并不能准确展示环状多肽或者通过重排方式形成的特征离子，如磺酸化杆菌肽经SO3中性丢失及氢转移后形成的烯基化离子[10]，B?hringer等[7]把m/z 650.2929归属为y5+NH3环状离子应是不恰当的。鉴于此，本文以化学结构式的方式呈现碎片离子并合理解释离子的产生途径，建立了结合HCD及CID模式的基于高分辨一级及二级质谱数据的darobactin A的结构解析策略，在“2.2”项下已有所表述。在本节中，对darobactin A的裂解規律（见图2）进行详细阐述，通过比较表1，在HCD和CID模式下较易碎裂产生b/y离子及脱氨基离子等，如b6（m/z 801.3315）、b5（m/z 714.2994）、y2（m/z 253.1183）、y1（m/z 166.0863）及a1（m/z 175.0866）；Darobactin上的Trp1容易失去一分子NH3得到具有共轭结构的碎片离子，如脱氨基darobactin A离子（m/z 949.3839）、b6-NH3（m/z 784.3049）、b5-NH3（m/z 697.2729）。Trp1-Trp3发生四元环重排及氢转移从而断裂C-O-C醚键而产生特征共轭结构离子y5-H2（m/z 650.2933），此过程可能为自由基SAM催化形成醚键的逆反应，称之为“逆向裂解途径”，见图2中所示，随后会依次失去Phe7、Ser6及1分子H2O得到特征离子y5-y1-H2（m/z 485.2143）、y5-y2-H2（m/z 398.1823）和y5-y1-H2-H2O（m/z 380.1717）。另外，m/z 650.2933也可能是具有Trp3-β位碳正离子结构的离子。Trp1-Trp3醚键断裂的同时可能伴生着Asn2-Trp3酰胺键的断裂从而形成b2-NH3（m/z 300.0979），并继而形成b1-NH3（m/z 186.0550）。在CID模式下，可以明显观察到离子m/z 160.0757，推测是Trp1残基失去1分子CO和NH3及H转移至α位后形成的离子，B?hringer等[7]通过折线方式呈现该离子的结构应是不正确的。

整体比较而言，HCD得到的离子信息较为全面，并且在高能碰撞下还可以得到C-C键断裂的离子，如a1丢失一分子亚甲胺得到吲哚亚甲基正离子m/z 146.0600，推测具有共轭结构的吲哚环稳定了该正离子。借鉴离子m/z 146.0600的结构，在HCD-MS/MS谱中发现并推导了碎片离子m/z 228.1495的结构，采用常规的断裂酰胺键、连接杂原子的键或重排反应均无法得到合理的结构，推测可能与Trp3-Lys5相关。Darobactin A-NH3断裂失去（Ser4+y2）后得到离子b5-NH3-Ser4（m/z 611.2481），继续丢失Lys5残基上的CO并经Trp3-β位碳上的氢转移得到离子m/z 582.2459，Trp1-Trp3之间的醚键发生断裂得到Trp3-Lys5残基的特征吲哚亚甲基正离子m/z 228.1595或与吲哚环的共轭离子。若Lys5残基被Arg取代而形成darobactin C或D，则该特征离子将是一个直接证据。离子m/z 611.2481和m/z 582.2459未观测到，仅作为推导m/z 228.1595的过渡态离子。

张琪等[5]在分析darobactin的生物合成路径时，曾推测Trp3-α， β位碳在自由基SAM催化下形成碳碳双键，并通过质谱捕获到了经双键化修饰的Trp3的多肽片段DarApk（43-53），所以本文推测在HCD或CID过程中经“逆向裂解途径”也会产生具有双键Trp3的特征离子，并得到了验证，如y5-H2。李进等[12-13]曾采用“逆羟醛缩合”的方式解析了万古霉素中的β-羟基间氯酪氨酸开环形成含有醛基的特征离子，如离子m/z 1306，而羟醛缩合反应是实现万古霉素杂质CDP-Ⅰ-Major和CDP-Ⅰ-Minor之间转化的途径。这说明“逆向裂解”在多肽类抗生素的结构解析中是合理的。

3.2 以darobactin B/D/E的碎片离子验证解析策略

以darobactin A为模型建立的解析策略可以适用于其他darobactin组分的碎片离子归属中，表1中对有可能出现在HCD或CID谱图中的离子m/z进行了总结，同时对出现错误的碎片离子的m/z进行了修正。darobactin B中4位氨基酸为Thr，6位氨基酸为Arg，主要发生变化的是与Thr4、Arg6相关的离子，如b6（m/z 884.4162）、b5（m/z 728.3151）及其脱氨基离子b6-NH3（m/z 867.3896）、b5-NH3（m/z 711.2885，B?hringer等[7]给出的m/z 697.2729有误）和y5-H2（m/z 733.3780）、y5- y2-H2（m/z 412.1979）、y2（m/z 322.1874），而b2-NH3未发生变化，这些离子基本与CID得到的碎片离子结果一致。Arg的引入是否会出现新的碎片离子暂不在讨论范围内。

Darobactin D的5位氨基酸为Arg，主要发生变化的是与Arg5相关的离子，如b6（m/z 829.3376，B?hringer等[7]给出的m/z 830.3454有误）、b5（m/z 742.3056）及其脱氨基离子b6-NH3（m/z 812.3111）、b5-NH3（m/z 725.2790）、和y5-H2（m/z 678.2994）、y5- y2-H2（m/z 426.1884，B?hringer等[7]给出的m/z 384.1666为脱去Arg5甲脒基后的离子）等，见图3，而b2-NH3、b1-NH3、y2及y1未发生变化，说明侧链结构未发生变化，这些离子基本与CID得到的碎片离子结果一致。如果能通过HCD获得Trp3-Arg5残基的特征离子m/z 256.1557，预测结构式见图3所示，则可以证明5位氨基酸为Arg。

Darobactin E的2位氨基酸为Ser，主要发生变化的是与Ser2相关的离子，如b6（m/z 774.3206）、b5（m/z 687.2885）及其脱氨基离子b6-NH3（m/z 757.2940）、b5-NH3（m/z 670.2620）、b2-NH3（m/z 273.0870），均比Darobactin A的相应离子少27（为Asn与Ser的分子量差值），其他离子如y5-H2、y5- y2-H2、y2未发生变化，如上碎片离子基本与CID得到的碎片离子结果一致。

3.3 Darobactin C/F的碎片离子预测

B?hringer等[7]未提供darobactin C和F的MS/MS谱图，根据本文所建立的解析策略，可以预测其特征碎片离子，具体的离子信息见表1。Darobactin C的2位氨基酸为Ser，5位氨基酸为Arg，主要发生变化的是与Ser2、Arg5相关的离子，如b6（m/z 802.3267）、b5（m/z 715.2947）及其脱氨基离子b6-NH3（m/z 785.3002）、b5-NH3（m/z 698.2681）、b2-NH3（m/z 273.0870）和y5-H2（m/z 678.2994）、y5- y2-H2（m/z 426.1884），而y2及y1未发生变化。与darobactin D类似，HCD图谱中也将获得Trp3-Arg5残基的特征离子m/z 256.1557。

Darobactin F中改变了3个氨基酸，分别为Lys2、Asn6和Leu7，发生变化的离子包括Darobactin F脱氨基离子（m/z 956.4625）、b6（m/z 842.3944）、b5（m/z 728.3515）及其脫氨基离子b6-NH3（m/z 825.3678）、b5-NH3（m/z 711.3249）、b2-NH3（m/z 314.1499）和y5-H2（m/z 643.3198）、y5- y1-H2（m/z 512.2252）、y2（m/z 246.1448）、y1（m/z 132.1019），见图4；其他与这3个位点无关的特征离子如b1-NH3、y5-y2-H2将不会有所变化。

4 结论

本研究根据已知darobactin组分在HCD或CID模式下的一级及二级质谱数据，建立了darobactin组分系统的结构解析策略，能够通过在线HPLC-MS快速判定darobactin已知组分的结构，并可以预测同源组分及其前体肽的裂解行为。针对darobactin的双环结构结合其生物合成路径，提出了“逆向裂解途径”来确证Trp1-Trp3醚键断裂生成的特征离子，并首次解析了Trp3-Lys5之间特殊碳碳键形成的特征离子，为判断5位氨基酸（如Lys被Arg取代）提供了直接证据。由于采用文献中披露的已知数据，可能因碎片离子的缺失导致解析策略不够完善，如Arg取代组分脱去甲脒基后的离子，尚需采用实际样品试验后再进行补充。

参 考 文 献

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