超声波辅助熬制三文鱼骨汤的工艺优化及其滋味评价

刘华林，林登峰，赵洪雷，徐永霞, ，李学鹏，励建荣，王明丽，季广仁

（1.渤海大学食品科学与工程学院，生鲜农产品贮藏加工及安全控制技术国家地方联合工程研究中心，海洋食品精深加工关键技术省部共建协同创新中心，辽宁锦州 121013；2.蓬莱京鲁渔业有限公司，山东烟台 265600；3.锦州笔架山食品有限公司，辽宁锦州 121007）

三文鱼（Salmon salar）又称大西洋鲑鱼，属于鲑亚科（Salmoninae）鲑属（Salmon），是一种洄游性深海鱼类，主要分布在大西洋、太平洋、北冰洋交接水域[1]。三文鱼有很高的营养价值，被誉为“鱼中至尊”，其肉质细嫩鲜美、口感爽滑，富含优质蛋白质、多不饱和脂肪酸、矿物质和维生素等营养物质，其中ω-3 高不饱和脂肪酸尤其是DHA 和EPA 对调节血脂、预防心脑血管疾病和保持脑组织健康有积极作用[2]。三文鱼作为一种高经济价值鱼类，冰鲜和冷冻三文鱼占据主要市场，食用方式以日式生鱼片为主，但其加工过程中会产生大量的副产物，如鱼皮、鱼头和鱼骨等[3]，其中鱼骨间仍保存部分鱼肉。目前，这些加工副产物未得到充分利用，造成了很大的资源浪费，并带来较大的环境负担，因此，开展三文鱼加工副产物的深加工和高值化利用已成为行业的迫切需求。

日本最早利用超微粉碎技术对鱼骨进行加工，研制开发出骨松、骨味素、骨味汁等产品。近年来，有学者利用鱼骨开发鱼骨汤等海鲜调味基料，但研究还不够系统和深入[4]。汤的传统烹制方法主要是炖、煮、煨、煲等，其耗时长，且存在加热不均匀等问题。为满足消费者需求，超声波和微波等新兴技术逐渐被关注，其中超声波作为一种新型绿色的非热加工技术，具有穿透力强、能耗少、效率高、重复性好等特点[5]，其原理是利用超声波与介质的机械作用，增加体系中的能量传递，造成空化效应、热效应和机械效应[6-7]。近年来，超声波辅助加热技术在食品加工中的应用研究被广泛关注。研究发现，超声辅助加热能够提供良好的传热特性，缩短肉汤的炖煮时间，弥补传统炖煮方式的不足[8]。此外，超声辅助炖制会显著影响鸡汤的香味，且可以减缓脂质氧化[9]。SIEWE等[10]研究发现超声辅助加热可以显著提升天然鱼香调味料的鱼香味和鲜味并能降低苦味。李璐等[11]研究表明超声辅助加热可以促进鲶鱼鱼头汤中水溶性蛋白等营养物质的溶出。目前，超声波在鱼骨汤中的应用较少，关于超声波辅助加热对鱼骨汤滋味特性及品质的影响研究鲜见报道。

本研究以三文鱼骨为原料，采用超声辅助加热的方式熬制鱼骨汤，以氨基酸态氮、可溶性蛋白质和感官评分为综合评价指标，利用响应面法优化超声辅助熬制工艺，并对不同熬制方式下鱼骨汤的滋味轮廓、核苷酸和游离氨基酸的含量进行分析比较，研究旨在为超声辅助熬制鱼汤及利用水产加工副产物开发海鲜调味基料提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

三文鱼骨 锦州市林西街水产市场；食盐 锦州市大润发超市；甲醛 辽宁泉瑞试剂有限公司；酒石酸、磷酸二氢钾 国药集团化学试剂有限公司；高氯酸、氢氧化钾、氢氧化钠、酒石酸钾钠、五水硫酸铜等均为分析纯，甲醇（色谱级）、IMP 标准品、AMP 标准品、GMP 标准品（纯度均≥99%） 阿拉丁试剂（上海）有限公司。

THC-1000SF 超声波煎煮锅 济宁天华超声电子仪器有限公司；UV-2550 紫外光谱仪 日本岛津公司；Insent SA402B 电子舌 日本Insent 公司；Agilent 1260Infinity 高效液相色谱仪 美国Agilent 公司；FiveEasy Plus FE28 pH 计 上海梅特勒-托利多仪器公司。

1.2 实验方法

1.2.1 三文鱼骨汤的制备 将三文鱼骨清洗干净后切成段，长度为5～6 cm，取大小均匀的鱼骨200±15 g，装入1 L 的蒸煮袋中，再加入适量的食盐和水，密封后置于95 ℃超声波煎煮锅中熬煮一定时间，冷却后过滤得到三文鱼骨汤。以未经超声处理熬煮的鱼骨汤作为传统加热组。

1.2.2 单因素实验设计

1.2.2.1 料水比对三文鱼骨汤品质的影响 确定盐添加量0.25%，超声时间90 min，超声功率600 W，考察不同料水比（1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6 g/mL）对三文鱼骨汤感官评分、可溶性蛋白质和氨基酸态氮含量的影响。

1.2.2.2 盐添加量对三文鱼骨汤品质的影响 确定料水比1:2 g/mL，超声时间90 min，超声功率600 W，考察不同盐添加量（0、0.25%、0.5%、0.75%、1%）对三文鱼骨汤感官评分、可溶性蛋白质和氨基酸态氮含量的影响。

1.2.2.3 超声时间对三文鱼骨汤品质的影响 确定料水比1:2 g/mL，盐添加量为0.5%，超声功率600 W，考察不同超声时间（30、60、90、120、150 min）对三文鱼骨汤感官评分、可溶性蛋白质和氨基酸态氮含量的影响。

1.2.2.4 超声功率对三文鱼骨汤品质的影响 确定料水比1:2 g/mL，盐添加量为0.5%，超声时间90 min，考察不同超声功率（0、400、600、800、1000 W）对三文鱼骨汤感官评分、可溶性蛋白质和氨基酸态氮含量的影响。

1.2.3 响应面优化试验设计 根据单因素试验结果，固定食盐添加量0.5%，选择料水比、超声时间和超声功率三个因素，利用Box-Behnken 设计原理，以可溶性蛋白质含量为响应值进行优化试验，试验因素及水平见表1。

表1 响应面试验因素及水平Table 1 Box-Behnken test factors and levels

1.2.4 感官评定 参照王媛媛等[12]的方法并作适当修改，选择8 名食品专业的研究生，经过感官培训后对鱼骨汤样品进行感官评价，结果取平均值。具体感官评价标准如表2 所示。

表2 三文鱼骨汤感官评分标准Table 2 Sensory evaluation criteria of salmon bone soup

1.2.5 氨基酸态氮和可溶性蛋白质含量的测定 鱼骨汤中氨基酸态氮的含量参照GB 5009.235-2016《食品安全国家标准食品中氨基酸态氮的测定》采用甲醛滴定法进行测定。

参照张维等[13]的方法采用双缩脲法测定鱼骨汤中可溶性蛋白质含量，鱼骨汤经200 目纱布过滤，在540 nm 波长下测定吸光度，结果取3 次测量的平均值。

1.2.6 电子舌测定 鱼汤样品于在7200 r/min（4 ℃）下离心15 min，取上清液稀释10 倍后过0.22 μm 滤膜，然后取适量样品于测试杯中，使用活化24 h 的电子舌传感器进行测定。每次检测120s，1 次/s，每个样品循环测定4 次，取后3 次数据进行分析。

1.2.7 呈味核苷酸的测定 参考He 等[14]的方法并稍作修改。取5 mL 样品加入15 mL 5%高氯酸，均质后离心（8000 r/min，10 min，4 ℃），取上清液备用，沉淀重复上述操作，合并两次上清液，并用5 mol/L KOH 调整pH 至6.75，用0.22 μm 滤膜过滤，滤液用高效液相色谱进行定量分析。

色谱条件：C18柱（5 μm，4.6 mm×250 mm），柱温28℃；流动相：由（A）pH4.5，0.05 mol/L KH2PO4和（B）甲醇组成，流速0.8 mL/min。

1.2.8 游离氨基酸的测定 鱼骨汤中游离氨基酸的含量参考GB 5009.124-2016《食品中氨基酸的测定》进行测定。

1.3 数据处理

每组实验3 次平行，利用Design-Expert 13 软件对实验结果进行响应面分析，采用Origin 9.0 软件绘图，利用SPSS 19.0 软件进行数据处理和方差分析，P＜0.05 表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果与分析

2.1.1 料水比对鱼骨汤可溶性蛋白质、氨基酸态氮和感官评分的影响 水的用量对鱼骨汤的品质和出品率具有重要影响。料水比主要通过改变浓度差和渗透压来影响原料中营养成分和呈味物质的溶出，合适的料水比有利于鱼骨中的固形物向汤中迁移，从而达到丰富营养、提升汤的品质的目的[15]。如图1 所示，随着料水比的增加，氨基酸态氮的含量逐渐下降，说明增加水的含量会产生一定程度的稀释作用。感官评分和可溶性蛋白质的含量随料水比的增加呈先上升后下降的趋势，其中可溶性蛋白含量的变化具有显著性差异（P＜0.05），而感官评分的变化不显著（P＞0.05），当料水比为1:2 时分别达到最大值，汤汁乳白清澈，滋味协调，无酸涩味。加水过少不利于营养成分和呈味物质的浸出，而加水过量则会降低溶出物的浓度，从而影响鱼骨汤的风味。综合考虑，选择最佳料水比为1:2 g/mL。

图1 料水比对鱼骨汤氨基酸态氮、可溶性蛋白质和感官评分的影响Fig.1 Effects of material-water ratio on amino nitrogen, soluble protein and sensory score of fish bone soup

2.1.2 盐添加量对鱼骨汤可溶性蛋白质、氨基酸态氮和感官评分的影响 盐被称为百味之王，它在汤品加工中具有重要作用，加入适量的盐不仅能提升汤的味道，还能促进原料中营养物质的溶出，提升汤的营养品质[16]。如图2 所示，随着盐添加量的增加，感官评分先上升后下降（P＞0.05），当盐添加量为0.5%时，鱼骨汤的咸味和鲜味协调，感官评分最高；当盐的添加量小于或大于0.5%时，鱼骨汤的整体风味过淡或者过咸，口感单一，回甘不足。随着盐添加量的增加，鱼骨汤中氨基酸态氮和可溶性蛋白质的含量呈逐渐上升的趋势，说明盐的添加能够促进鱼骨中蛋白质的溶出和降解，产生更多的游离氨基酸，赋予鱼骨汤良好的营养和风味品质[17]。综合考虑，选择最佳盐添加量为0.5%。

图2 盐添加量对鱼骨汤氨基酸态氮、可溶性蛋白质和感官评分的影响Fig.2 Effects of salt content on amino nitrogen, soluble protein and sensory score of fish bone soup

2.1.3 超声时间对鱼骨汤可溶性蛋白质、氨基酸态氮和感官评分的影响 如图3 所示，随着超声时间的延长，鱼骨汤中氨基酸态氮、可溶性蛋白含量和感官评分先上升（P＜0.05），当超声时间为90 min 时达到最大值；之后随时间延长又逐渐下降。超声波处理可以促进肌原纤维蛋白结构的断裂，其具有的空化作用还会增加水的穿透力，从而加速鱼骨中蛋白质、脂肪等物质的溶出速率，增加鱼骨汤中可溶性蛋白质的含量，提升鱼骨汤的整体风味和感官品质[18]。此外，超声波处理会使水分子解离形成具有强氧化性的羟基自由基，促进蛋白质的降解，从而提高鱼骨汤中游离氨基酸的含量。当超声时间大于90 min 时，随着时间的继续延长，容易导致蛋白质降解或聚集[19]，从而使可溶性蛋白含量有所下降；此外，长时间的熬煮会使鱼汤中的游离氨基酸和还原糖发生美拉德反应[20]，导致氨基酸态氮含量下降，同时鱼骨汤的酸味和涩味也逐渐显现。综合考虑，选择最优超声时间为90 min。

图3 超声时间对鱼骨汤氨基酸态氮、可溶性蛋白质和感官评分的影响Fig.3 Effects of ultrasonic time on amino nitrogen, soluble protein and sensory score of fish bone soup

2.1.4 超声功率对鱼骨汤可溶性蛋白质、氨基酸态氮和感官评分的影响 如图4 所示，随着超声功率的增加，鱼骨汤中氨基酸态氮含量逐渐上升；可溶性蛋白质含量和感官评分先上升（P＜0.05），在超声功率为800 W 时分别达到最大值，之后随功率增大又出现下降趋势。这是因为超声波的空化效应和细胞破碎作用随超声强度的增大而增强，使鱼骨中蛋白质的溶出效率增强，从而提高鱼骨汤中可溶性蛋白的含量[11]。此外，高功率的超声处理对蛋白质结构的影响也会增大，促进更多的亲水性氨基酸基团暴露在表面，从而增加鱼骨汤中氨基酸态氮的含量[21]。感官评定结果表明，当超声功率为800 W 时三文鱼骨汤的感官品质最好。综合考虑，选择最佳超声功率为800 W。

图4 超声功率对鱼骨汤氨基酸态氮、可溶性蛋白质和感官评分的影响Fig.4 Effects of ultrasonic power on amino nitrogen, soluble protein and sensory score of fish bone soup

2.2 响应面优化实验结果与分析

2.2.1 响应面优化试验设计结果 通过单因素试验，确定了各因素的水平范围，并以料水比（A）、超声时间（B）和超声功率（C）为自变量，以可溶性蛋白质含量为因变量 ，采用Box-Behnken 设计进行响应面优化，试验设计及结果如表3 所示。

表3 Box-Behnken 试验设计结果Table 3 Box-Behnken test design and results

2.2.2 回归方程显著性检验 对响应面试验结果进行拟合分析，得到可溶性蛋白质与各因素的二次回归模型方程为：

对二次回归方程进行显著性检验，结果如表4所示，所得回归方程的显著性极高（P＜0.0001），回归系数R2=0.9916，失拟项P=0.0515＞0.05，表明该模型拟合度较好，可信度高。由F值大小可知，各因素对鱼骨汤中可溶性蛋白质含量的影响程度依次为超声时间（B）＞超声功率（C）＞料水比（A），同时表中AC 和BC 的P＜0.01，说明超声功率与超声时间、超声功率与料水比有较强的相互作用，对鱼骨汤中可溶性蛋白质含量的影响更加显著。

表4 可溶性蛋白质回归模型的方差分析Table 4 Variance analysis of regression mode of soluble protein

2.2.3 响应曲面分析 响应面图可以直观的反映因素间的交互作用，等高线形状接近于圆形，曲面坡度平缓，表明二者的交互作用弱；反之，等高线形状接近于椭圆形，曲面坡度陡峭，表明两者间的交互作用强[13]。由图5 可以看出，超声时间与超声功率的相互作用最强，料水比一定时，可溶性蛋白质含量随超声时间和超声功率的增加呈先上升后下降的趋势，且曲面陡峭，等高线趋于椭圆形，表明超声时间和超声功率之间交互作用显著；当超声时间一定时，随着料水比与超声功率的增加，可溶性蛋白质含量先增加后降低，曲面坡度陡峭，其等高线形状呈椭圆形，说明料水比与超声功率之间的相互作用显著。

图5 因素交互作用对鱼骨汤可溶性蛋白质含量的影响Fig.5 Effects of factors interaction on soluble protein content of fish bone soup

2.2.4 响应面试验最佳工艺和验证实验 通过响应面分析得到超声辅助加热熬制三文鱼骨汤的最优工艺参数为：料水比1:1.85 g/mL，超声时间96.78 min，超声功率825.57 W。结合实际可操作性，将最优工艺参数调整为：料水比1:2 g/mL，超声时间96 min，超声功率800 W，在此条件下进行3 次验证实验，得到鱼骨汤的可溶性蛋白含量为192.30 mg/mL，感官评分为8.43，氨基酸态氮含量为0.036 g/100 mL。最佳工艺下的测定结果与模型预测值的相对误差均＜5%，表明该模型优化得到的工艺条件具有可行性。

2.3 电子舌分析

电子舌是通过味觉传感器对样品的感官属性进行分析，通过提取各传感器的响应值建立了传统加热和超声辅助加热制备三文鱼骨汤的滋味雷达图，结果如图6 所示。由图6 可知，鱼骨汤中酸味、咸味、涩味及其回味响应值均在无味点以下，说明其是无效的味觉评价指标[22]。鲜味、丰富度和苦味的响应值较高，是影响三文鱼骨汤滋味的主要味觉指标，其中传统加热组鱼骨汤的鲜味值、丰富度和苦味值分别为4.89、1.0 和4.58，超声辅助加热组的鲜味值和丰富度分别增加至5.8 和3.44，而苦味值下降至4.29。两种方式下熬制的鱼骨汤中苦味和涩味及其回味的差异不明显。丰富度代表了样品滋味的丰富程度和持久性，与鲜味物质的含量和种类密切相关，可见超声辅助加热促进了鱼骨汤中呈鲜物质的溶出。咸味主要是由一些中性盐离子产生的滋味，可在一定程度上增强其它味觉的感知，比如鲜味[23]。这可能是因为超声辅助加热促进了鱼骨汤熬制过程中蛋白质的降解以及小肽、游离氨基酸和核苷酸等呈味物质的溶出，从而提升鱼骨汤的风味品质[24]。

图6 不同熬煮方式鱼骨汤的滋味雷达图Fig.6 Taste radar chart of fish bone soup by different cooking methods

2.4 呈味核苷酸分析

核苷酸及其关联化合物是形成鱼鲜味的重要组成成分，核苷酸和呈味氨基酸之间具有协同作用，两者共存时能够产生更强烈的鲜味[25]。由表5 可知，在三文鱼骨汤中检测出5'-GMP、5'-IMP 和5'-AMP 3 种呈味核苷酸，其中传统加热组中呈味核苷酸的总量为41.95 mg/100 mL，经超声辅助加热后呈味核苷酸总量增加至47.35 mg/100 mL，这几种核苷酸含量的增加对于提升鱼汤的鲜味有重要作用。由表可知，超声波辅助熬制的鱼汤中AMP 和GMP 的含量显著高于传统加热组（P＜0.05），而IMP 的含量有所下降（P＞0.05）。研究表明，AMP 和IMP 主要是由三磷酸腺苷（ATP）的降解产生，AMP 能够促进甜味的感知，IMP 是一种理想的风味增强剂，与鱼骨汤中的游离氨基酸谷氨酸共存时具有增强鲜味的效果[26]。GMP 是IMP 转化的产物，也具有较强的风味增强活性，且GMP 在增强产品风味方面的能力约是IMP 的2.3 倍[27]。超声波辅助加热能有效促进鱼骨中三磷酸腺苷的降解[28]，从而使AMP 的含量升高；此外，超声处理可能会促进IMP 的转化，从而使其含量有所降低。

表5 不同熬煮方式对鱼骨汤中呈味核苷酸的影响Table 5 Effects of different cooking methods on 5'-nucleotides of fish bone soup

2.5 游离氨基酸分析

游离氨基酸丰富的呈味特性与汤类滋味的形成密切相关[29]。图7 为传统加热和超声辅助加热熬制的鱼骨汤中游离氨基酸含量的聚类分析热图，可用来区分两种不同加工方式下鱼骨汤的游离氨基酸组成差异。由图可见，三文鱼骨汤中共检测出11 种游离氨基酸，传统加热组中以具有苦味的Val、Ile 和赋予鱼汤甜味的Gly、Ala、Ser 和Thr 为主，超声辅助加热组中鲜味氨基酸Asp、Glu 和苦味氨基酸His、Lys和Leu 的含量增加，可能是由于超声的热效应和空化作用加速了蛋白质的水解以及游离氨基酸向汤中的迁移。Glu、Gly、Ala 和Asp 是重要的风味氨基酸，特别是作为鲜味氨基酸的Glu 和Asp，对鱼骨汤鲜美滋味的形成具有重要作用[14]。虽然超声组鱼汤中苦味氨基酸含量升高，但苦味氨基酸不具有味觉活性，且易被鲜味和甜味物质掩盖，可能对鱼骨汤的整体滋味影响较小[30]。

图7 不同熬煮方式对鱼骨汤中游离氨基酸的影响Fig.7 Effect of different cooking methods on free amino acids of fish bone soup

3 结论

本研究通过单因素和响应面试验对超声波辅助热处理熬制三文鱼骨汤的工艺进行优化，得到较佳的工艺参数为料水比1:2 g/mL、超声时间96 min、超声功率800 W，经重复性实验验证，得到此条件下三文鱼骨汤的可溶性蛋白质含量为192.30 mg/mL，氨基酸态氮含量为0.036 g/100 mL，感官评分为8.43，与模型预测值之间的相对误差为小于5%，说明此模型可靠性较高，有较强的实用性。电子舌和核苷酸分析结果显示，与传统加热相比，超声波辅助加热能够增强鱼骨汤的鲜味强度、丰富度和咸味强度，降低酸味强度，增加鱼骨汤中呈味核苷酸以及鲜味氨基酸的含量，提高三文鱼骨汤的风味品质。