吴茱萸碱对小鼠肝纤维化的影响

孙建超,张 艺,张娜佳,娄方方

1.贵州省临床检验中心,贵州贵阳 550002;2.贵州医科大学,贵州贵阳 550002;3.贵州省人民医院检验科,贵州贵阳 550002

肝纤维化是病理损伤、病毒性肝炎、非酒精性脂肪肝、酒精性肝炎等众多疾病的共同病理过程,遗传性新陈代谢失调、药物损伤、胆汁淤积性疾病、免疫功能失调等均可导致肝纤维化[1]。因此,肝纤维化是对急、慢性肝损伤的创伤应答反应,该反应几乎是所有终末期肝病及其并发症的基础,包括门静脉高压、腹水、肝性脑病、合成功能障碍和代谢能力受损等,长期的肝脏损伤导致细胞外基质(ECM)增生、肝纤维化形成[2]。研究表明,肝纤维化是可逆的肝脏损伤过程[3],及时有效的干预可阻止肝脏向肝硬化或肝癌进展。因此,研究肝纤维化的发病机制及有效的干预措施对肝纤维化的防治具有重要的临床意义。

1 材料与方法

1.1实验动物 32只C57BL/6J小鼠均购自贵州医科大学动物实验中心,SPF级实验室饲养,按照随机数字表法分为对照组、模型组、吴茱萸碱低剂量组、吴茱萸碱高剂量组,每组8只,自由饮水,普通饮食。

1.2主要试剂 吴茱萸碱;丙二醛(MDA)试剂盒(南京建成生物工程研究所有限公司);3型胶原蛋白(Col-Ⅲ)单克隆抗体(美国Abcam公司);α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA) 单克隆抗体(美国Abcam公司);细胞基质金属蛋白酶-9(MMP-9)单克隆抗体(美国Abcam公司);增殖细胞核抗原(PCNA)单克隆抗体(美国Abcam公司);BCA蛋白定量试剂盒 (南京巴傲得生物科技有限公司);增强型化学发光(ECL)试剂(德国 Millipore公司)。

1.3方法

1.3.1小鼠肝纤维化造模流程 参考文献[4],采用10% 四氯化碳(CCL4)在模型组、吴茱萸碱低剂量组、吴茱萸碱高剂量组中复制小鼠肝纤维化模型;橄榄油∶CCL4=9∶1配制10% CCL4混合溶剂;吴茱萸碱的溶剂为吐温,配制吐温∶二甲基亚砜(DMSO)∶生理盐水=1∶1∶18的混合溶剂;每周1、3、5按0.5 mL/kg的剂量经腹腔注射10% CCL4,每周小鼠称重,调整药物剂量,重复12周。造模过程中,吴茱萸碱低剂量组给予吴茱萸碱溶液20 mg/(kg·d),吴茱萸碱高剂量组给予吴茱萸碱溶液25 mg/(kg·d)进行灌胃干预。模型组和对照组只注射10% CCL4混合溶剂。

1.3.2小鼠血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)水平检测 小鼠摘眼球采集血液标本,以3 000 r/min离心10 min分离血清。ALT、AST均采用SiemensAdvia 1650全自动生化分析仪按试剂盒说明书要求进行检测。

1.3.3小鼠肝组织MDA水平检测 取小鼠肝组织,制备肝组织匀浆,采用硫代巴比妥酸法检测MDA水平,严格按照试剂盒说明书要求操作。

1.3.4免疫组化法检测 肝组织切片经脱蜡、抗原修复、封闭、一抗孵育、二抗孵育、显色后,每张切片随机选取5个低倍视野(×100),采用免疫组化法检测Col-Ⅲ、α-SMA表达情况。

1.3.5PCNA蛋白、MMP-9水平检测 取小鼠肝组织,制备肝组织匀浆,采用免疫印迹法按试剂盒说明书提取蛋白并定量。取20 μg蛋白,变性处理后进行聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶电泳,转PVDF膜,一抗PCNA(1∶1 000)、MMP-9(1∶5 000),4 ℃孵育过夜。二抗(1∶20 000)室温孵育1 h,TBST缓冲液清洗后暗室内ECL试剂显色、曝光。通过Image J软件进行灰度分析。

2 结 果

2.1各组小鼠血清ALT、AST水平比较 与模型组比较,吴茱萸碱低剂量组、吴茱萸碱高剂量组小鼠血清ALT、AST水平明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 各组小鼠血清ALT、AST水平

2.2各组小鼠肝组织MDA水平比较 对照组、模型组、吴茱萸碱低剂量组、吴茱萸碱高剂量组MDA水平分别为(0.857±0.044)、(1.394±0.047)、(0.993±0.021)、(0.911±0.03)nmoL/mg,与模型组比较,吴茱萸碱低剂量组、吴茱萸碱高剂量组小鼠肝组织MDA水平均明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。

2.3各组小鼠肝组织免疫组化法检测结果 对照组小鼠肝组织中Col-Ⅲ可见于汇管区和中央脉管壁表达,但量极少,染色较淡;模型组Col-Ⅲ表达广泛,呈弥漫性,主要表达在中央静脉周围及纤维组织增生的汇管区的纤维间隔、肝窦壁、血管内皮细胞和胆管上皮细胞细胞质,形成宽而粗大的纤维条索。吴茱萸碱低剂量组、吴茱萸碱高剂量组Col-Ⅲ阳性表达部位与模型组一致,但表达面积和强度有所减少和减弱。见图1。

注:A为对照组;B为模型组;C为吴茱萸碱低剂量组;D为吴茱萸碱高剂量组。

对照组小鼠肝组织中α-SMA仅在肝内动脉、静脉、胆管壁表达。模型组小鼠α-SMA除在血管壁表达外,主要在纤维间隔及汇管区的成纤维母细胞细胞质处表达明显,且呈梭形或长椭圆形。吴茱萸碱低剂量组、吴茱萸碱高剂量组α-SMA阳性表达部位与模型组一致,但表达面积和强度有所减少和减弱。见图2。

注:A为对照组;B为模型组;C为吴茱萸碱低剂量组;D为吴茱萸碱高剂量组。

2.4各组小鼠肝组织免疫印迹法检测结果 与模型组比较,吴茱萸碱低剂量组、吴茱萸碱高剂量组小鼠肝组织MMP-9表达上调,PCNA蛋白表达下调,差异均有统计学意义(P<0.05)。见图3、4。

注:A为对照组;B为模型组;C为吴茱萸碱低剂量组;D为吴茱萸碱高剂量组。

注:a为MMP-9表达情况比较;b为PCNA蛋白表达情况比较;A为对照组;B为模型组;C为吴茱萸碱低剂量组;D为吴茱萸碱高剂量组;与模型组比较,*P<0.05。

3 讨 论

吴茱萸为《神农本草经》所记载的一味中药,药性辛、苦、热,有小毒。其功效主要为助阳止泻、散寒止痛、温中止呕。吴茱萸碱为吴茱萸主要活性成分之一,有广泛的药理活性,对心血管系统[5]、内分泌系统[6]、免疫系统[7]等均有较强的调节作用,表明吴茱萸碱在抗氧化应激损伤方面有重要作用。

肝纤维化是所有慢性肝损伤长期刺激转归的必经之路,一旦进入肝硬化阶段则难以逆转。经过大约40年的基础、转化和临床研究的稳步进展,人们对肝硬化和终末期肝病的发病机制有了深入的认识[8]。肝纤维化因其较高的发病率及病死率严重威胁人类健康,全球约1亿人口受到肝纤维化的影响[9]。肝纤维化的显著特点为肝组织内大量ECM成分过度增生及异常沉淀[10],其特征是纤维ECM产生和降解不平衡,导致间质胶原及其他基质成分积聚。肝纤维化的发生、发展与机体氧化应激反应紧密相关,机体氧化应激状态刺激肝星状细胞(HSC)活化及炎症细胞与细胞因子、肝巨噬细胞等多种因素,参与肝细胞损伤及肝小叶结构的重构。其中HSC的活化是肝组织内纤维胶原积累的关键因素[11],是肝纤维胶原的主要来源。研究表明,α-SMA是HSC活化的重要标志,α-SMA在HSC中表达的强度与HSC的活化程度呈正相关[12]。肝组织中的胶原主要分为Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅵ型等,其中以Ⅰ型胶原蛋白(Col-Ⅰ)、Col-Ⅲ最多,占肝脏ECM总量的95%以上,因此,Col-Ⅰ、Col-Ⅲ是肝纤维化、肝硬化时ECM的主要成分[13]。本研究中免疫组化法检测结果显示,吴茱萸碱低剂量组、吴茱萸碱高剂量组纤维间隔及汇管区的Col-Ⅲ、α-SMA表达面积和强度与模型组比较均有所减少和减弱,表明吴茱萸碱在抑制HSC的活化及抑制肝组织内纤维胶原积累方面有较好的作用。

基质金属蛋白酶(MMPs)是一类结构相似的锌依赖性内肽酶家族,MMP-9是MMPs家族的主要成员之一。MMP-9能够水解胶原蛋白、蛋白聚糖、弹性蛋白及纤连蛋白,通过降解ECM参与许多生物过程,在肝纤维化、肿瘤等多种疾病的发生、发展中有重要作用[14-15]。MMP-9更是为数不多的可以降解Ⅳ型胶原等多种基质胶原的蛋白酶[16]。国内外诸多文献报道了MMP-9与肝纤维化发生、发展的关系,认为MMP-9可作为肝纤维化程度及肝细胞状态的可靠评价指标[17-19]。本研究结果表明,与模型组比较,吴茱萸碱低剂量组、吴茱萸碱高剂量组肝组织中MMP-9表达上调,差异有统计学意义(P<0.05)。王豫萍等[20]研究发现蓝莓果浆在猪血清诱导大鼠免疫性肝纤维化损伤中可增加肝组织MMP-9表达。因此,MMP-9在降解ECM进而抑制肝纤维化中起重要作用,可能与吴茱萸碱的防护肝纤维化、水解ECM、防止肝组织内纤维胶原积累的功能有关。

肝纤维化是伴随着肝细胞的不断损伤与修复的过程。DONATO等[21-22]研究了慢性肝炎和肝硬化患者的肝脏组织标本PCNA蛋白表达水平,发现其能反映慢性病毒性肝炎患者的肝细胞增殖率,与肝病的严重性相关。胡沛臻等[23]研究表明,在慢性肝炎、肝细胞不典型增生、肝细胞肝癌中,病情严重程度与PCNA蛋白表达量增加相关,即PCNA蛋白的表达水平与组织的分化程度呈负相关。本研究结果表明,与模型组比较,吴茱萸碱低剂量组、吴茱萸碱高剂量组PCNA蛋白表达下调,差异有统计学意义(P<0.05),可能与吴茱萸碱能抑制肝细胞过度增殖,减轻肝细胞损伤有关。

综上所述,吴茱萸碱对CCL4诱导小鼠肝纤维化有显著防护效果,可能与吴茱萸碱抑制肝组织氧化应激反应,同时抑制HSC活化,提高MMP-9表达,降低肝组织周围Col-Ⅲ水平,同时下调PCNA蛋白表达有关。