重组酶聚合酶扩增技术用于脑脊液中肺炎链球菌检测的价值*

侯玉婷,俞梦楚,王妍柏,张 庆

宁夏医科大学总医院:1.神经内科脑脊液检测室;2.医学科学研究院;3.神经内科,宁夏银川 750004

细菌性脑膜炎是由细菌直接侵入中枢神经系统(CNS)引起的严重感染性疾病,其发病率和病死率居高不下[1-2]。脑脊液(CSF)微生物培养是临床诊断细菌性脑膜炎的常规方法之一,同时也是诊断的金标准,但由于细菌培养时间长,不能满足临床的早期诊断和指导临床合理用药需求。因此,快速、准确地检测CSF中的致病菌是神经科医生关注的重点,也是医学检验需要面临的问题。重组酶聚合酶扩增(RPA)是一种等温基因核酸扩增技术,因其快速、特异、可靠等特点成为新的病原微生物分子诊断方法[3-5]。RPA可在恒温条件下,20 min内进行DNA检测,反应效率高。前期的研究发现,本院收治的肺炎链球菌性脑膜炎患者较多[6],因此本研究以肺炎链球菌为目的菌株。LepA蛋白是核糖体延伸因子,在原核生物中具有高度的序列保守性[7]。本研究以LepA基因作为鉴定肺炎链球菌的分子诊断靶点,利用RPA技术检测CSF中肺炎链球菌,以CSF微生物培养的结果作为标准,探讨RPA技术的应用价值。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集2020年5月至2021年5月本院收治的确诊及疑似细菌性脑膜炎患者52例为研究对象,其中男32例,女20例;年龄0.5～82.0岁。

1.2仪器与试剂 PCR仪(Analytikjena 德国)、Bio-Rad电泳仪(Bio-Rad 美国)、凝胶电泳仪(Azure美国)、Cytospin-4型细胞玻片离心仪(Thermo Scientific 美国)。瑞氏-姬姆萨染色液(珠海贝索生物技术有限公司)、TopRed核酸染料(北京博奥拓达科技有限公司)、DNA提取试剂盒(QIAamp DNA mini Kit 德国)、DNA纯化回收试剂盒(天根生化科技有限公司)、RPA反应试剂盒(TwistAmpTMBasic Kit 英国)。

1.3方法

1.3.1引物设计与合成 根据GenBank肺炎链球菌LepA基因(Genbank accession number NC_018594.1)的核酸序列及参考文献[8]设计RPA引物,正向引物:ACAGCTCCGTCTGTTATTTACAAAGTTAATTTGA C;反向引物:AGTCCCCACGCTTACGCTGAGCT AGCTCCATTACT。扩增片段长度均为190 bp,引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3.2CSF微生物培养 52例患者均进行常规CSF微生物培养,按照临床检验操作规程对CSF标本进行微生物分离鉴定。

1.3.3CSF细胞学检查和DNA提取 进行腰椎穿刺取CSF,采用血细胞计数板进行CSF中白细胞计数。吸取0.5 mL CSF置于标本室内,放置在细胞玻片离心仪内以113×g离心5 min制成CSF涂片。待涂片自然干燥后,滴加瑞氏-姬姆萨染色液,然后加入缓冲液并吹均匀,静置5 min后流水冲洗。干燥后采用CSF细胞图像诊断分析系统进行分类,计数100个细胞,计算单个核细胞(淋巴细胞、单核细胞)和多个核细胞(中性粒细胞)百分比[9]。剩余的CSF在室温下12 000 r/min离心10 min,弃去上清液;按照试剂盒中说明书的操作方法提取CSF的DNA,检测核酸浓度及纯度后置于-20 ℃保存备用。

1.3.4CSF RPA检测 将CSF标本的DNA按照TwistAmpTMBasic Kit试剂盒的说明书进行RPA检测。反应体系如下:10 μmol/L的上、下游引物各2.4 μL,重组缓冲液29.5 μL,DNA模板1 μL,ddH2O 12.2 μL,涡旋混匀后简短离心。将上述47.5 μL的混合液移入预装有冻干粉的反应管中并充分混匀,再加入280 mmol/L的醋酸镁溶液2.5 μL,混匀后置于40 ℃恒温仪中反应4 min。将反应管从恒温仪中取出,上下翻转混匀8～10次,简短离心后再次置于40 ℃恒温仪中反应16 min。

1.3.5RPA产物的结果判断 按照DNA纯化回收试剂盒的说明书将RPA反应产物进行纯化,测定核酸浓度及纯度后,通过1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测。

1.3.6RPA产物的验证 根据琼脂糖凝胶电泳检测的结果,选取部分阳性扩增产物送往上海生工生物工程有限公司进行测序,通过生物软件VectorNTI分析临床标本RPA产物的核酸序列与目标核酸序列的一致程度,验证扩增产物是否为目的条带。

1.4统计学处理 采用Excel 2007软件进行数据分析。

2 结 果

2.1CSF微生物培养结果 CSF经微生物培养有19例(36.5%)为阳性。其中肺炎链球菌为7例;鲍曼不动杆菌5例;肺炎克雷伯菌2例;脑膜炎奈瑟菌、流感嗜血杆菌、单核细胞增生李斯特菌、缓症链球菌和黏质沙雷菌分别为1例。CSF微生物培养阴性者为33例(63.5%)。

2.2CSF RPA检测的结果 52例研究对象中,RPA阳性为14例(26.9%),阴性为38例(73.1%)。CSF标本的RPA产物电泳图见图1,阳性标本能扩增出清晰的RPA条带,且条带大小符合预期长度(190 bp)。

注:M为DNA分子质量标准;1～4为CSF标本(患者编号为1、3、4和6号)。

2.3RPA与微生物培养结果比较 微生物培养为阳性的19例(36.5%)患者中,有7例检出肺炎链球菌,这7例的RPA检测结果均为阳性。微生物培养为阴性的33例(63.5%)患者中,也有7例的RPA检测结果为阳性。这7例患者药物治疗史和CSF细胞学检查结果见表1。有12例患者CSF标本的培养结果为非肺炎链球菌,其RPA反应均为阴性。

表1 培养为阴性、RPA检测为阳性患者的药物治疗史和细胞学检查结果

2.4RPA产物的测序结果 CSF微生物培养和RPA检测结果均为肺炎链球菌的7例患者,随机选取3例(标本编号3、9、14)RPA产物进行测序。CSF微生物培养为阴性,RPA反应为阳性的7例患者的产物全部进行测序。共10份RPA的核酸产物与LepA基因的190 bp目标序列进行序列比对,结果见图2。图中黄色代表相同的序列;蓝色代表相似的序列。测序时由于荧光染料的干扰,测序结果在引物3′端后面的10～30个碱基不一定能准确判读。在第45个碱基位置(箭头所示)以后RPA产物的核酸序列与目标序列一致,RPA扩增成功并获得目的基因片段。

注:图中黄色代表相同的序列;蓝色代表相似的序列;箭头为第45个碱基位置。

3 讨 论

细菌性脑膜炎的病情进展快,严重威胁人们的生命健康,需要早期诊断并及时给予有效的治疗。因此快速、准确的病原菌检测是临床确诊细菌性脑膜炎的关键。在微生物分子检测方法中,PCR技术为病原菌的诊断提供了依据,已应用于CNS感染性疾病的诊断中[10-11]。基因芯片技术在细菌性脑膜炎的诊断中也可见报道[6,12-13]。但这两种方法都需要特定的仪器、设备和专业的人员,检测成本较高,在快速检测方面有不足之处。近年来,RPA技术以其快速、灵敏度高、特异性强的特点受到人们的关注,已应用于细菌、病毒和寄生虫等检测研究中[14-17]。RPA技术在恒温条件下(25～43 ℃),20 min即可实现核酸指数扩增,这种常温扩增的优点使得该技术不需要精密的仪器,为床旁诊断提供了可能,满足了临床快速诊断的需求。

LepA蛋白也被称为 EF4,是与蛋白质翻译密切相关的延伸因子,也是一个高度保守的蛋白,其编码基因LepA在原核生物中具有高度的序列保守性[7]。有报道采用LepA 基因对血液中肺炎链球菌进行了核酸扩增检测,研究发现肺炎链球菌的8株参考菌株和19株临床分离株的检测结果均为阳性,其余54株非肺炎链球菌菌株的检测结果均为阴性,该研究表明LepA基因作为肺炎链球菌的检测靶点具有较好的特异度和灵敏度[8]。

基于上述研究结果,本研究以LepA基因为分子诊断靶点,利用RPA技术检测临床CSF标本中的肺炎链球菌,以CSF微生物培养的结果作为标准,探讨RPA技术的应用价值。

研究表明RPA技术检测时间短,恒定40 ℃、20 min即可完成核酸的扩增,加上CSF DNA的提取和核酸产物凝胶电泳的时间,可以在1 d内得到检测结果。在本研究中,RPA检出肺炎链球菌的阳性率为26.9%(14/52),微生物培养技术检出肺炎链球菌的阳性率为13.5%(7/52)。微生物培养结果为肺炎链球菌的7份CSF标本,其RPA检测结果为阳性,两种检测方法结果一致。另外有7份CSF标本,其微生物培养结果为阴性,但是RPA检测结果为阳性。这7例患者在本院就诊前,均有当地医院就诊史,根据患者的资料信息,笔者认为这7例患者是因为使用抗菌药物而降低了微生物培养的敏感性,患者CSF的中性粒细胞百分比为60%以上且中性粒细胞吞噬细菌的能力强,所以微生物培养结果为阴性,但是CSF中存在肺炎链球菌的核酸物质,因此RPA结果为阳性。需要注意的是,本研究中的RPA引物是检测肺炎链球菌的特异性引物,所以微生物培养结果为非肺炎链球菌的标本RPA检测结果为阴性。

为进一步确认RPA产物序列的正确性,将10份RPA阳性产物纯化后与LepA基因目标序列进行核酸序列比对。从图2可知,31号标本有9个位点的碱基与目的片段的碱基不一致,考虑31号标本中的肺炎链球菌在这9个位点发生了单个核苷酸的变异,其余9份RPA阳性产物的核酸序列与目标序列一致。该结果表明RPA成功扩增出目的基因片段。

RPA技术可快速、准确地检测出CSF中的肺炎链球菌,有助于临床对肺炎链球菌性脑膜炎的早期诊断和治疗,也为细菌性脑膜炎其他病原菌的快速检测提供借鉴。CSF病原菌的检测方法,如微生物培养技术、革兰涂片染色、免疫学及生化指标检测等方法都各有优势。RPA技术应该与这些检测方法相互结合,相互补充,使得病原菌的检测不断向着简单快速、准确度高、床旁适用的方向发展。