长沙地区禽源mcr-1 肠杆菌流行病学调查

王文静，杜阳洋,文立华,杨 俊,王红兵，王 慧，杜丽 飞,刘俊琦※，周望平※

（1.湖南省畜牧兽医研究所，湖南长沙 410131；2.湖南农业大学，湖南长沙 410128）

抗生素一直是人类抵御各种感染性疾病的主要武器，随着耐药菌报道的日益增多，人类健康公共安全受到威胁。2009 年，Yong 等人首次发现“超级细菌”新德里金属β-内酰胺酶（NDM-1），并证实NDM-1 能介导细菌对几乎所有β-内酰胺类药物耐药[1]。2015 年，沈建忠团队在大肠杆菌分离株中发现了一种新的质粒介导的抗多黏菌素基因mcr-1[2]。多黏菌素类药物是治疗碳青霉烯耐药肠杆菌科细菌( Carbapenem-resistant enterobacteriaceae,CRE）最有效的药物，被认为是治疗碳青霉烯耐药菌感染的“最后一道防线”[3]，然而，当前黏菌素耐药性的流行已经成为一个重大的公共卫生安全问题[2]。

有研究报道，从意大利的住院患者的大肠杆菌样品中检测到了mcr-1 黏菌素耐药基因，虽然临床分离所得株耐药率较低，不过总体较为稳定[4]。研究者从食物中分离出mcr 耐药基因[5-7]，这表明mcr-1已经在全球范围内传播[8]，这些研究都表明了黏菌素耐药基因mcr-1 传播途径的复杂性。随后研究在野生动物的排泄物中检测到了黏菌素耐药基因[9]。

我国在2017 年4 月30 日正式禁用黏菌素作为动物促生长剂[22]。但是，随着近年来革兰氏阴性菌多重耐药性（MDR）的产生[10]，耐药率的激增，让人类着重考虑健康安全问题，因为缺乏可以击败这些“超级细菌”的新抗生素，以及重要的可用和有效的抗生素通常无法对抗MDR 革兰氏阴性病原体[11]，故多黏菌素类药物又被重新考虑起来。有研究表明黏菌素耐药的不同机制，包括内在、突变和可转移机制。

近年来，从动物食品中分离出的微生物中携带多黏菌素耐药基因，这引发人们对动物未使用抗生素却检测出相关抗生素的讨论。所以通过调查研究食源性动物，禽源动物的MCR-1 阳性肠杆菌的耐药率，可以得知目前多黏菌素的耐药程度，加以干预目前小型鸡场、散鸡养殖户滥用药物的现状，以防对人类生命安全造成威胁，也防止这种抗生素的持续以来并控制黏菌素耐药性的传播[12]。

1 材料与方法

1.1 样本来源

从湖南长沙某屠宰场采集鸡源泄殖腔拭子23份，从湖南长沙某生鲜市场采集鸡源泄殖腔拭子52 份、鸽源泄殖腔拭子8 份、环境样本40 份。

1.2 主要试剂及设备

琼脂粉，阿莫西林、噻孢霉素、替加环素、庆大霉素、氧氟沙星、头孢吡肟、氯霉素、林可霉素等药敏试验药物购自Solarbio；TSB 琼脂购自OXOID；麦康凯琼脂购自杭州微生物试剂有限公司；琼脂糖购自Biosharp；SuperRed /GelRed 核 酸 染 料 购 自Biosharp；硫酸粘杆菌素购自麦克林；Biospin 细菌基因组DNA 提取试剂盒购自杭州博日科技股份有限公司。

立式压力蒸汽灭菌器购自上海博讯实业有限公司医疗设备厂；BS-600L 电子天平购自上海友声衡器有限公司；H1650-W 医用离心机购自长沙高新技术开发区湘仪离心机仪器有限公司；BHS-1 水浴锅购自JOANLAB；Opticlean-1300 洁净工作台购自力康精密科技（上海）有限公司；DYY-6C 型电泳仪购自北京市六一仪器厂；AG22331 普通PCR 仪购自德国eppendorf；Tanon3500R 凝胶成像系统购自上海天能；Multiskan FC 型酶标仪购自上海赛默飞世尔仪器有限公司。

1.3 试验方法

样本采集后，加入2 mL TSB 液体培养基富集化培养2～3 h，接种于含有2 μg/mL 硫酸多黏菌素药物的麦康凯培养基中，37℃温箱培养12～16 h，筛选出黏菌素耐药菌，使用细菌基因组DNA 提取试剂盒，按照说明书进行细菌基因组提取。

1.3.2 耐药菌株培养与保存

将纯化后的菌株接种于普通培养基中富集化，加入2mL30%甘油和液体培养液1∶1 混合液，刮取菌落，抽取至离心管中，于-80℃冰箱保存。

1.2.3 PCR 鉴定

据NCBI 上已发表的大肠杆菌的MCR-1 基因（参考菌株：KU743383.1，位置28185-29810），用BLAST 进行特异性和保守型比较分析，引物由北京擎科生物科技有限公司合成，引物序列见表1。

表1 细菌核酸检测引物信息

挑选麦康凯培养基中目的菌落接种于普通培养基中纯化，使用mcr-1 引物进行鉴定。PCR 反应运行体系25 μL，其中模板2 μL，mcr-1 上游引物1 μL，mcr-1 下游引物1μL，2×Ex Taq Premix12.5 μL，灭菌纯水8.5 μL。

1.3.4 抗菌药物敏感性实验

按照美国临床和实验室标准协会抗菌药物敏感性试验( Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）和欧洲临床微生物和感染病学会药敏委员会 ( EUropean Committee for Antimicrobial Susceptibility Testing，EUCAST）标准[13-14]，采用微量肉汤稀释法检测耐药菌株对8 种药物的最低抑菌浓度（MIC）包括氧氟沙星、头孢吡肟、林可霉素、噻孢霉素、阿莫西林、替加环素、庆大环素、氯霉素，药敏试验结果判断参照文献[15]。

2 结果

2.1 肠杆菌的分离

采集的123 份样品中，共分离到119 株肠杆菌，其中禽源屠宰场22 株、生鲜市场97 株（包括鸡源50 株，环境39 株，鸽源8 株）。

2.2 耐药菌分离鉴定

119 株肠杆菌中分离到21 株含有mcr-1 耐药基因的肠杆菌（17.6%，21/119），其中屠宰场分离得3 株、生鲜市场分离得18 株（其中鸡源14 株，环境3 株，鸽源1 株），分离结果见表2。

表2 样本分组Table2 Grouping ofSamples

2.3 药敏试验结果

17 株mcr-1 多黏菌是耐药菌对氧氟沙星、头孢吡肟、林可霉素、噻孢霉素、阿莫西林、替加环素、庆大环素、氯霉素等抗生素的MIC 值见表3。17 株肠杆菌对林可霉素和阿莫西林耐药率均为100%，对氯霉素耐药率为94%，对庆大环素耐药率为88%，对氧氟沙星耐药率为76%，对噻孢霉素耐药率为65%，对替加环素耐药率为0%（图1）。17 株肠杆菌对2 种药物耐药菌株占5.9%（n=1），对3 种药物耐药菌株占5.9%（n=1），对5 种药物耐药菌株占23.5%（n=4），对6 种药物耐药菌株占38.9（n=7），对7 种药物耐药菌株占23.5%（n=4）。

图1 药物对耐药菌株的耐药率Fig.1 Resistance rate ofeight drugsto resistant strains

表3 抗菌药物敏感性测试结果Table3 Antimicrobial susceptibility test results

肠杆菌科细菌是一种常见的机会致病菌，主要导致肺炎、腹腔感染等，随着“超级细菌”的出现，人们对多黏菌素药物的依赖日益增加。近年来，由于多黏菌素耐药基因mcr-1 的出现，人们又开始担忧公众安全问题，在国内颁发黏菌素禁药政策后，黏菌素耐药率也在逐渐下降。

本试验中，可以观察到，提取出的17 株mcr-1耐药阳性菌株对林可霉素、阿莫西林的耐药率较高，与Song 等研究结果基本一致[23]；替加环素耐药率为0%，说明替加环素还未在本地区大范围使用，可能是碳青霉烯耐药菌感染的理想治疗抗生素。在药敏试验中发现，药敏试验与耐药菌株的结果相一致，大多数mcr-1 阳性大肠杆菌对氧氟沙星、头孢吡肟及替加环素较为敏感，可能与样本来源地较少使用该类药物有关；同时，这些阳性菌株对噻孢霉素的药敏性呈现出较大差异，而噻孢霉素较青霉素效果较差且较为昂贵，一般很少在养殖业用到，在以往研究中也很少提到，出现差异的原因耐人寻味。值得注意的是，F6、F30、H17、G2 等菌株对试验中八种抗生素中大多数都存在较强的耐药性，说明这几种菌株已经出现多重耐药性，未来可能发展成为“超级耐药细菌”。

另外，生鲜市场和屠宰场的鸡粪便中mcr-1 阳性率都超过10%，生鲜市场的鸡和鸽子大多来源于散养户，这说明长沙地区大肠杆菌对多黏菌素耐药情况较为严重，家禽养殖户可能存在黏菌素滥用泛用的行为。在生鲜市场周围所采集的环境样本中也检出3 株mcr-1 阳性株，可能是人类活动过程中携带的黏菌素耐药基因传播到了自然环境中，或是禽类生活过程中将携带的黏菌素耐药基因传播到了其他自然环境中。屠宰场粪便、生鲜市场粪便和环境中均检测到耐药基因，说明动物与环境之间存在相互传播，且有进一步传染到人体的可能性，这与王警等[24]研究中提出的观点一致。各类屠宰场应该严格制定管理条例并严格执行，做好动物的健康监测，正确处理排放废水或污水，及时消毒，做好环境保障工作。

如今mcr-1 耐药菌肆虐，危害公共健康，而多黏菌素类药物被限制使用，“最后一道防线”药物所剩无几，为防止人类和动物在往后的疾病侵袭中陷入无药可用的境地，市场要加强药物管理，严格执行兽药专用；养殖户应当加强饲养管理，减少药物滥用。 □