马来穿山甲葡萄球菌分离鉴定和耐药性分析

姚 艳，逯金瑶，吴耀祥，吴慧，朱晋梅，宋林，唐松元，李 立

（湖南省生物多样性保护中心，湖南长沙 410004）

马来穿山甲（Manis javanica） 属于鳞甲目（Pholidota）鲮鲤科（Manidae）鲮鲤属（Manis）[1]，是全球现存的8 种穿山甲之一，世界自然保护联盟（IUCN）将其列为极危（CR）物种。亚洲分布有4 种穿山甲：中华穿山甲（M. pentadactyla）、马来穿山甲（M. javanica）、印度穿山甲（M. crassicaudata）、菲律宾穿山甲（M. culionensis）；其余4 种分布在非洲，分别是：大穿山甲（M. gigantea）、树穿山甲（M.tricuspis）、南非穿山甲（M. temminckii）以及长尾穿山甲（M. tetradactyla）。国内中华穿山甲主要分布于长江以南，云南省西南地区分布有少量印度穿山甲和马来穿山甲，穿山甲野外食物较单一，主要以白蚁和蚂蚁为食。由于穿山甲的肉与鳞片具有被吹捧起来的经济价值，致使其成为世界上遭受非法贸易最严重的哺乳动物。大规模的非法狩猎与非法贸易导致野生穿山甲种群数量锐减。除此之外，栖息地的破坏也对穿山甲的野外种群数量有很大影响。2016 年，在第17 届国际贸易公约大会上，穿山甲科所有物种均被列入CITES 附录Ⅰ；其中，中华穿山甲、马来穿山甲被升级为极度濒危等级，另外6种穿山甲也均升级为濒危等级。我国把国内分布的3 种穿山甲均列为国家I 级重点保护动物，列为《中国濒危动物红皮书·兽类》中易危种（V）。

国内外学者们都是通过生态学、行为学和疾病等方面对圈养和野生穿山甲进行研究[2-5]。本研究从中心救护的马来穿山甲的脾脏、肝脏、肾脏等内脏器官样品无菌分离培养获得单一菌株，对分离菌株进行16Sr DNA 鉴定和序列分析，最终确定致病菌为葡萄球菌，同时对分离菌进行药敏实验，以期对马来穿山甲葡萄球菌病的诊治提供参考依据。

1 材料

1.1 样品来源

患病马来穿山甲为中心救护个体，发病马来穿山甲主要表现为食欲不振、精神沉郁、鼻腔有黏液分泌物、呼吸不畅、等症状。病马来穿山甲死亡后送实验室进行病理剖检。

1.2 试剂和设备

营养琼脂培养基、血琼脂培养基、K-B 法药敏纸片（25 种）、细菌微量生化鉴定管、0.5 麦氏比浊管、DNA 提取试剂盒、2000DNAMarker、PCR 反应预混酶、50× TAE、琼脂糖、生化培养箱、PCR 仪、电泳仪、凝胶成像系统、显微镜、水浴恒温荡挡器、纯水仪、超净台、电子天平、抗生素药敏片等。

2 方法

2.1 病原分离培养

将无菌采集死亡马来穿山甲的肝脏、肺脏、肾脏等脏器接种于营养肉汤增菌；取24 h 的增菌营养肉汤培养物划线接种于营养琼脂平板进行纯化培养；纯化菌落用高温灼烧后的接种环蘸取少量病变组织液接种巧克力琼脂平板、血琼脂平板培养基表面，在37℃恒温箱中培养24 h 后，涂片革兰氏染色，镜检。

2.2 细菌16S rDNA 基因序列扩增

将镜检疑似菌落按照细菌基因组DNA 小量提取试剂盒说明书的步骤提取分离菌的DNA。以分离菌的基因组为模板，利用设计的16S rDNA 通用引物在PCR 仪内进行目的基因的扩增。反应条件：94℃变性4 min；94 ℃30 s，57 ℃30 s，72 ℃1 min，共30 个循环；72℃10 min。 用2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR 产物。将特异性扩增产物送至通用生物实验公司测序，并在NCBI 数据库进行对比分析。通用引物为：16SrRNA-27F:5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，16SrRNA-1492R:5'-GGCTACCTTGTTACGACTT-3’。

2.3 药敏试验

挑取纯培养的菌落到灭菌生理盐水，调节其浓度为0.5 麦氏单位。灭菌棉签蘸取菌悬液，均匀涂布在普通琼脂平板上，菌液吸附数分钟后，再用灭菌镊子将药敏纸片均匀贴在平板的表面，37℃培养24 h 后，用游标卡尺测定抑菌圈直径，游标卡尺测定抑菌圈直径并记录，测量3 次取平均值。结合2013 版美国临床检验标准委员会（CLSI）判读标准，将所有菌株试验结果分为敏感（S）、中度敏感（I）、耐药（R）。

3 结果

3.1 剖检变化

对患病马来穿山甲剖检时，发现个体肺脏弥漫性充血、出血，肌肉样变，肺间质增宽，肝脏、肾脏有出血点（图1～图3）。

图2 肾脏病理变化Fig.2 Pathologicalexamination of spleen

图3 肝脏病理变化Fig.2 Pathologicalexamination of liver

3.2 培养特性

菌株在血平板培养基上培养24 h 后，形成灰白色、不透明，表面光滑，大而突起、边缘整齐的小菌落（图4）。革兰染色镜检菌株呈紫色，单个、双或串状的革兰阳性菌（图5）。

图4 分离菌株培养形态Fig.4 Colony morphology of bacterialisolates

图5 分离菌株革兰氏染色观察Fig.5 Grain staining observation of bacterialisolates

3.3 分离株16S rDNA 鉴定

用细菌通用引物对其16S rDNA 基因序列进行扩增，凝胶电泳结果（图6）所示，该菌株16S rDNA基因序列PCR 产物大小约1500 bp。将纯化菌液送往测序公司，测序结果在GenBank 中进行搜索、比对，结果显示与葡萄球菌（OM758218.1、MT409899.1、MT4099900.1、LC437030.1、MG798679.1、MG798672.1、KT372844.1、MH179469.1、MK43941.1）聚为一大枝，有可能为同一菌株。

图6 分离株16SrDNA 的PCR 扩增Fig.6 PCR amplification of16SrDNAgene from bacterialisolates

3.4 药敏试验结果

对分离菌株进行药敏试验（结果见表1），参考美国临床检验标准委员会（CLSI）检定所的纸片琼脂扩散标准判定结果。由表1 可知，分离菌株对丁胺卡那霉素、新霉素高敏感，头孢塞肟、头孢他啶中度敏感，对青霉素、恩诺沙星、卡拉霉素、环丙沙星等耐药。

表1 分离菌的药敏试验结果

4 结论与讨论

穿山甲是哺乳动物纲中最小的类群之一，主要分布于我国南部、尼泊尔和中南半岛等地。目前，对马来穿山甲体内细菌的研究较少，何梅红[7]等研究报道马来穿山甲肠道细菌有变形杆菌属、埃希氏菌属- 志贺氏菌属、肠球菌属、假单胞菌属、普罗威登斯菌属、葡萄球菌属等细菌，刘根[8]等研究报道死亡的马来穿山甲肺脏分离出奇异变形杆菌。

图7 遗传进化树（注：sample3 为本试验分离株）Fig.7 Phlyogenetic tree

本研究从死亡马来穿山甲的脾脏、肝脏、肾脏等内脏器官样品中，分离出致病菌，通过形态学特性、培养特性、分离株16S rDNA 鉴定结果，证明分离的菌株为葡萄球菌。葡萄球菌是人与动物机体中的一种重要病原菌，可能会诱发口腔黏膜、皮肤与鼻腔等组织感染，在兽医临床上通常会表现为皮肤、软质感染，诱发牛羊乳腺炎，很可能会造成动物病死。本研究通过药敏试验发现，该分离株对丁胺卡那霉素、新霉素高敏感，头孢塞肟、头孢他啶中度敏感，对青霉素、恩诺沙星、卡拉霉素、环丙沙星等耐药。徐春萍等[9]、徐国[10]、王丽坤[11]等结果也表明，丁胺卡娜对金黄色葡萄球菌有较强的抑制作用，而对头孢哌酮、头孢噻肟、恩诺沙星、链霉素中度敏感。因此，在治疗葡萄球菌感染的临床治疗中应根据药敏试验结果采取联合用药、合理用药，从而有效提高药物的治疗效果，避免由于应用无效药物对马来穿山甲产生不良反应。 □