下肢动脉硬化闭塞症患者介入手术后血清微小RNA-206水平变化及临床意义

左 东，张 宇，朱怀宇，张 童

1 清华大学医院外科，北京 100084 2 北京航天总医院血管外科，北京 100076 3 北京清华长庚医院血管外科，北京 102218

下肢动脉硬化闭塞症（lower extremity arteriosclerosis obliteran，LEASO）是一种慢性下肢缺血性疾病，与动脉粥样硬化形成的斑块导致动脉膜变厚、血管阻塞有关[1]。由于人们生活方式的改变、人口老龄化的加剧等原因，LEASO 的发病率逐渐升高[2]。LEASO 患者的早期症状并不明显，但在出现间歇性跛行、肢体缺血性溃疡、静息痛等症状时，病情已经十分严重，继续拖延可能会导致截肢，严重影响患者的身心健康[3]。目前，LEASO 的主要治疗方法是血管移植术或介入手术，其中，血管移植术的创口较大，不适合中老年龄患者；介入手术具有创口小、恢复快的特点，临床应用较多[4]，但患者在介入手术后容易发生血管再狭窄，因此，寻找有效的生物标志物对于早期评估患者的预后并及时给予干预措施尤为重要。微小RNA（microRNA，miRNA）是一类高度保守的非编码小分子单链RNA，由miRNA 本身及其靶基因形成复杂而精密的调控网，可参与调节多种重要的生物学功能[5]。miRNA-206属于miRNA 家族的一员，在骨骼肌细胞的发育、生长、繁殖、凋亡中发挥重要的作用[6]。miRNA-206作为心脏生理活动的调控因子，在心血管疾病中发挥着重要的作用，既可以作为诊断标志物，也可以通过靶向作用来治疗疾病[7]。研究表明，冠状动脉粥样硬化患者的血清miRNA-206水平明显高于健康者[8]。然而，目前关于LEASO 患者介入手术后miRNA-206水平变化情况及临床意义方面的研究鲜有报道，因此，本研究对LEASO 患者介入手术后miRNA-206水平变化情况及临床意义进行探讨，以期为临床诊断和治疗提供参考依据，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2019年9月至2021年9月于北京清华长庚医院接受手术治疗的LEASO患者的临床资料。纳入标准：（1）符合关于LEASO的诊疗标准[9]；（2）临床资料完整；（3）6个月前未使用激素类药物。排除标准：（1）合并其他免疫系统疾病；（2）妊娠期或哺乳期女性；（3）合并严重的肝肾功能障碍；（4）合并全身急慢性感染性疾病；（5）合并凝血功能障碍；（6）合并恶性肿瘤。根据纳入、排除标准，最终共纳入83例LEASO患者作为LEASO组，其中，男性45例，女性38例；年龄43～72岁，平均（57.46±13.34）岁；体重指数20～25 kg/m2，平均（22.51±2.36）kg/m2；吸烟27例，饮酒31例；高血压28例。同时选取同期80例健康体检者作为对照组，其中，男性39例，女性41例；年龄43～71岁，平均（56.75±12.85）岁；体重指数19～25 kg/m2，平均（22.16±2.41）kg/m2；吸烟23例，饮酒25例；高血压21例。两组研究对象的临床特征比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。根据预后的不同将LEASO组患者分为再狭窄组（n=39）和非再狭窄组（n=44）。

1.2 方法

1.2.1 miRNA-206水平检测

采集LEASO组患者术前24 h、术后24 h、术后1个月、术后6个月的空腹静脉血5 ml，采集对照组体检时空腹静脉血5 ml，均置于抗凝管中；以3500 r/min的速度离心20 min，提取上层血清液，置于-80℃冰箱中储存待检。按照Trizol试剂盒说明书的步骤操作，提取组织中的总RNA，并检测其浓度和纯度，使用逆转录试剂盒反转录成cDNA，以cDNA为模板，采用实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative realtime-polymerase chain reaction，qRT-PCR）仪检测血清中miRNA-206水平。内参为U6，引物经设计软件设计后由广州辉骏生物科技股份有限公司合成。miRNA-206引物序列：正向引物为5'-GACTCTGGGAGTGACAAGGC-3'；反向引物为5'-AGATTGGTGGTTACCGCTGG-3'。U6引物序列：正向引物为5'-GCTGGACTCTAGGGTGCAAG-3'；反向引物为5'-GAGCATACCAGGTGGTAGTAG-3'。qRT-PCR反应体系共20 µl：cDNA（50 ng/µl）2 µl，SYBR Green Master Mix（2×）10 µl，PCR上下游引物（10 µmol/L）各1 µl，加ddH2O至20 µl。条件为95℃预变性15 min，1个循环，然后在95℃变性15 s，65℃退火延伸45 s，共40个循环。为了减小实验误差，各样品重复3次，使用2-ΔΔCt方法分析miRNA-206水平。

1.2.2 观察指标

采用酶联免疫吸附试验检测并比较LEASO组和对照组术前（入院时）血清血小板活化因子（platelet activating factor，PAF）、C 反应蛋白（C reactive protein，CRP）、miRNA-206水平，比较再狭窄组和非再狭窄组患者术后6个月的临床特征、不同时间（术前、术后24 h、术后1个月、术后6个月）miRNA-206水平，分析LEASO患者介入手术后发生再狭窄的危险因素，分析血清miRNA-206对LEASO 患者介入手术后1个月发生再狭窄的预测价值。

1.3 统计学分析

应用SPSS 25.0软件对数据进行统计学分析。计数资料以n（%）表示，组间比较采用χ2检验；计量资料以（x±s）表示，组间比较采用t检验；多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验；采用多因素Logistic回归模型分析LEASO患者介入手术后发生再狭窄的影响因素；绘制受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线并计算曲线下面积（area under the curve，AUC），分析血清miRNA-206对LEASO患者介入手术后发生再狭窄的预测价值。AUC ＞0.9为较高预测价值，0.7＜AUC ≤0.9为中等预测价值，0.5≤AUC ≤0.7为较低预测价值，AUC ＜0.5为基本不具有预测价值。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LEASO 组和对照组术前血清PAF、CRP、miRNA-206水平的比较

LEASO组的术前血清PAF、CRP、miRNA-206水平分别为（5.24±1.73）ng/ml、（4.12±1.36）mg/L、（1.87±0.54），均明显高于对照组的（3.23±1.16）ng/ml、（2.51±0.85）mg/L、（1.01±0.29），差异均有统计学意义（t=8.680、9.020、12.600，P＜0.01）。

2.2 再狭窄组和非再狭窄组患者术后6 个月临床特征的比较

术后6个月，再狭窄组患者血清PAF、CRP 水平均明显高于非再狭窄组患者，差异均有统计学意义（P＜0.01）；两组患者的年龄、性别、体重指数、吸烟情况、饮酒情况、高血压情况、HDL-C水平、LDL-C水平、FPG水平、植入支架数量、eGFR水平、TG水平、TC水平比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。（表1）

表1 再狭窄组和非再狭窄组患者术后6个月临床特征的比较

2.3 手术前后再狭窄组与非再狭窄组患者miRNA-206 水平的比较

术后1、6个月，再狭窄组患者的miRNA-206水平均高于非再狭窄组患者，差异均有统计学意义（P＜0.05）；术前、术后24 h，再狭窄组与非再狭窄组患者的miRNA-206水平比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。（表2）

表2 手术前后再狭窄组与非再狭窄组患者miRNA-206水平的比较（±s）

表2 手术前后再狭窄组与非再狭窄组患者miRNA-206水平的比较（±s）

组别术前 术后24 h 术后1个月术后6个月再狭窄组（n=39） 1.89±0.56 1.84±0.52 1.72±0.43 1.53±0.39非再狭窄组（n=44）1.85±0.53 1.81±0.51 1.52±0.40 1.32±0.21 t值0.3340.2652.1953.102 P值0.7390.7920.0310.003

2.4 LEASO 患者介入手术后发生再狭窄影响因素的多因素分析

以miRNA-206水平、术后6个月PAF 水平、术后6个月CRP 水平的实测值作为自变量，以LEASO患者是否发生再狭窄作为因变量（否=0，是=1），纳入多因素Logistic回归模型中进行分析，结果显示，miRNA-206高表达、PAF 高表达、CRP 高表达均是LEASO患者介入手术后发生再狭窄的独立危险因素（P＜0.05）。（表3）

表3 LEASO患者介入手术后发生再狭窄影响因素的多因素分析

2.5 miRNA-206 对LEASO 患者术后1 个月发生再狭窄的预测价值

ROC曲线分析结果显示，miRNA-206诊断LEASO患者术后1个月发生再狭窄的AUC为0.831（95%CI：0.803～0.942），cut-off值为1.671，灵敏度为91.13%，特异度为76.08%。（图1）

图1 miRNA-206预测LEASO患者术后1个月发生再狭窄的ROC曲线

3 讨论

LEASO是一种慢性疾病，其中，炎性反应会引起细胞的脂质沉积，从而引发动脉粥样硬化，导致管腔闭塞，主要临床表现为皮肤温度降低、下肢溃疡，若不及时处理，容易导致截肢等，严重影响患者的健康[10-11]。介入手术是一种微创手术，在临床上广泛应用，但术后容易发生再狭窄，影响预后[12]，因此，寻找有效标志物对LEASO患者的预后进行评估对于改善患者的预后极为重要。

miRNA是转录后调控基因表达水平的调节因子，通过与靶向miRNA 互补，从而在调控基因的表达中发挥重要的作用[13]。miRNA通过调控免疫细胞的分化功能在免疫反应中发挥重要的作用，其与很多疾病的发生、进展有关，因此可以作为一些疾病的诊断标志物[14]。miRNA-206是miRNA家族的一员，由21个核苷酸组成，位于6p12.2染色体上[15]。miRNA-206具有促进炎症反应的作用，Ye等[16]的研究发现，miRNA-206在骨关节炎患者血清中的表达水平升高，可以通过调节Th17失衡促进骨关节炎的发展，推测miRNA-206抑制可能是治疗骨关节炎的一种治疗策略。有研究表明，miRNA-206作为炎症功能的重要指标，与对照组相比，冠状动脉血流缓慢患者的miRNA-206的表达水平显著升高[17]。Wang 和Bai[18]的研究表明，miRNA-206是环状RNA跨膜7超家族成员3（circular RNA transmembrane 7 superfamily member 3，circTM7SF3）的下游靶向分子，而circTM7SF3可以通过上调miRNA-206的水平来增加β-羟化酶的表达，在动脉粥样硬化细胞模型中促成氧化低密度脂蛋白诱导损伤。本研究中，LEASO患者手术前后的miRNA-206水平均较高，且术前miRNA-206水平明显高于术后，另外，LEASO组术前的miRNA-206水平高于对照组，推测miRNA-206水平的升高促进了动脉粥样硬化斑块的形成，导致LEASO发生；术后，miRNA-206水平逐渐降低，炎性反应减少，且术后1、6个月，再狭窄组患者的miRNA-206水平均高于非再狭窄组患者，差异均有统计学意义，说明miRNA-206水平可能与LEASO患者的不良预后有关。本研究中，术前、术后24 h，再狭窄组与非再狭窄组患者的miRNA-206水平比较，差异均无统计学意义，表明患者未发生再狭窄时的miRNA-206水平无明显差异。

介入手术后再狭窄的发生机制较为复杂，涉及炎性反应等多种过程。炎性反应在发生再狭窄的过程中发挥着重要的作用[19]。PAF 是一种血小板激活剂，具有促进炎性反应和促进血栓形成的作用，在动脉粥样硬化的形成过程中发挥着重要的作用[20]。CRP是一种炎症因子，其水平升高可以损伤血管内膜，导致动脉粥样硬化形成[21]。本研究发现，术后6个月，再狭窄组患者血清PAF、CRP水平均明显高于非再狭窄组患者，差异均有统计学意义，说明PAF、CRP 也参与了动脉粥样硬化的发病过程，参与了LEASO的发生、发展。本研究发现，miRNA-206高表达、PAF 高表达、CRP 高表达均是LEASO患者介入手术后发生再狭窄的独立危险因素，推测miRNA-206、PAF 和CRP 水平的升高共同促进了动脉粥样硬化的形成。本研究亦发现，miRNA-206表达水平对LEASO患者术后1个月发生再狭窄具有预测价值，可以将miRNA-206表达水平作为预测LEASO患者介入手术后发生再狭窄的标志物，监测其表达水平有助于降低患者预后不良的风险。

综上所述，miRNA-206表达水平的升高与LEASO 患者介入手术后发生再狭窄有关，可以作为预测LEASO 患者介入手术后发生再狭窄的标志物。本研究选取的样本量较少，可能导致研究结果出现一定的偏倚，后续会扩大样本量，对其作用机制进一步深入研究，以期为临床诊断和治疗提供依据。