基于斑块稳定性对比青年与老年ApoE-/-小鼠冠状动脉粥样硬化的特点

张悦 舒刘芳 孙英新 姜希娟 王一婧

(1天津中医药大学,天津 301617;2佛山市南海区人民医院;3天津体育学院社会体育与健康科学学院)

随着全球大多数国家步入老年化社会,以动脉粥样硬化(AS)为基本病理特征的冠心病发病率逐年上升。据世界卫生组织(WHO)调查结果显示,尽管近年来发生AS的人群越来越趋向年轻化,但老年人仍是急性心血管事件发生的主要群体〔1〕,81%的心血管病患者死亡年龄>65岁〔2〕。随着年龄增加,AS的危险因素如高血压、糖尿病、高脂血症等发病率显著增加。以上研究提示年龄对AS的发生发展有重要影响。

AS斑块的稳定性与斑块纤维帽厚度、脂核大小、浸润的炎细胞数量等密切相关〔3〕。AS斑块局部发生的炎症反应及细胞外基质降解等病理变化,常可导致斑块内出血、斑块破裂等一系列严重继发性改变。衰老是AS发生的独立危险因素〔4〕,可促进AS的发生发展。随着年龄增长,AS斑块局部的炎症细胞、炎症因子和趋化因子等的比例发生变化,提示不同年龄段AS发生的病因、病变及其主要机制存在差异。本实验以载脂蛋白E基因敲除(ApoE-/-)小鼠冠状AS模型为研究对象,观察老年与青年小鼠冠状AS形态学差异,并在此基础上进一步分析青年与老年ApoE-/-小鼠AS斑块稳定性的相关指标差异及存在差异的可能机制,为未来临床针对AS个体化治疗方案的选择提供理论和科学参考依据。

1 材料与方法

1.1实验动物 8周龄、32周龄SPF级雄性ApoE-/-小鼠及相同遗传背景及匹配周龄C57BL/6J小鼠,由北京维通利华实验动物技术有限公司提供,动物生产许可证号:SCXK(京)2014-0004。

1.2实验饲料 高脂饲料(21%乳脂+0.15%胆固醇),批号MD12015,购于江苏美迪森生物医药有限公司。

1.3实验试剂 总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和油红O试剂盒购于南京建成生物工程研究所;单核细胞趋化蛋白(MCP)-1酶联免疫吸附试验(ELISA)测定试剂盒购自武汉Cloud-Clone Crop;Masson染色试剂盒购于北京索莱宝生物科技有限公司;CD68、细胞间黏附分子(ICAM)-1和血管细胞黏附因子(VCAM)-1兔单克隆抗体购于美国abcam公司;基质金属蛋白酶(MMP)9兔多克隆抗体购于北京博奥森生物技术有限公司;磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)小鼠单克隆抗体购于万类生物科技;ICAM-1和VCAM-1引物购于生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.4模型分组与制备 以8周龄C57BL/6J野生型小鼠作为青年对照(QC)组,以32周龄C57BL/6J 野生型小鼠作为老年对照(LC)组,以8周龄 ApoE-/-小鼠作为青年模型(QM)组,以32周龄 ApoE-/-小鼠作为老年模型(LM)组。适应性饲养1 w后,采用高脂饲料喂养模型组,用普通饲料喂养对照组,实验周期共28 w,建立ApoE-/-小鼠冠状动脉AS模型。

1.5体质量观察及评价AS斑块 在造模过程中,每周观察体质量变化。实验干预28 w结束后,用乙醚麻醉小鼠,采用小动物彩超仪检测主动脉弓,以评估动脉AS斑块的形成。

1.6血清学指标检测 实验干预28 w结束后,获取血清,参照说明书,分别采用微板法检测TG、TC、LDL-C、HDL-C水平,ELISA法检测MCP-1水平。

1.7冠状动脉斑块苏木素-伊红(HE)、Masson和油红O染色观察 预冷生理盐水灌流去除血管内残余血液,取主动脉根部平面的组织,部分于甲醛溶液固定或冰冻,常规石蜡或冰冻连续切片,分别行Masson、HE和油红O染色。用 Leica Qwin Image Processing and Analysis 软件分析切片染色结果,测量主动脉根部水平冠状动脉主干处 AS斑块面积、胶原纤维含量和斑块内脂质含量。

1.8免疫组织化学法检测CD68及MMP9在冠状动脉AS斑块中的表达 石蜡切片常规脱蜡至水,行免疫组化染色,使用IPP图像分析软件分析免疫组化染色结果,测量主动脉根部水平冠状动脉主干处AS斑块面积(PA)、斑块内阳性表达面积/阳性细胞总数,计算斑块内阳性面积的百分比(阳性面积/PA)。

1.9石蜡切片普鲁士蓝染色检测冠状动脉斑块内出血情况 石蜡切片常规脱蜡至水,参照普鲁士蓝染色检测说明书进行。待切片干燥后显微镜下拍片,用Leica Qwin Image Processing and Analysis软件分析普鲁士蓝染色结果,测量PA、计数斑块内出血点总数,计算斑块内校正出血点百分比(斑块内出血点总数/PA)。

1.10RT-q聚合酶链反应(PCR)法检测主动脉 ICAM-1 及 VCAM-1 RNA表达 裂解液裂解主动脉,RNA提取试剂盒提取总RNA,测定其浓度和纯度,按照试剂盒要求反转录为cDNA。ICAM-1 及 VCAM-1为目的基因,GAPDH为内参基因,引物序列(5′→3′):GAPDH上游引物:GTTACCAGGGCTGCCTTCTC,下游:GATGGTGATGGGTTTCCCGT;ICAM-1上游引物:TTCACACTGAATGCCAGCTC,下游:GTCTGCTGAGACCCCTCTTG;VCAM-1上游引物:ATTTTCTGGGGCAGGAAGTT,下游:ACGTCAG-AACAACCGAATCC。长度分别为177、182、238 bp。扩增条件为95 ℃预变性15 min,95 ℃变性10 s,60 ℃退火 30 s,最后72 ℃延伸30 s。

1.11Western印迹法检测主动脉 ICAM-1 及 VCAM-1 蛋白表达 主动脉匀浆,试剂盒提取主动脉总蛋白,二喹啉甲酸(BCA)法蛋白定量均一,100 ℃水浴10 min蛋白变性。聚丙烯酰胺凝胶蛋白电泳,转膜,加入ICAM-1(100 kD,1∶5 000)、VCAM-1(100 kD,1∶5 000)和β-actin(42 kD,1∶1 000)一抗过夜,后加入相应二抗,显影,凝胶成像并用分析系统分析。

1.12统计学分析 采用SPSS25.0软件进行LSD-t检验,检验水准(α)为 0.05。

2 结 果

2.1小鼠超声与体质量变化 实验干预 28 w结束后,超声图结果显示:两模型组主动脉及颈动脉均可见明显斑块形成,而同年龄段对照组无或少见斑块。两模型组高脂饮食 28 w后,体质量较普通饮食喂养的相应对照组体质量明显增加(均P<0.01),LM组较QM组体质量增加更明显(P<0.05)。见图1、表1。

表1 各组体质量、血清TC、LDL-C、HDL-C、TG、MCP-1水平比较

图1 超声心动图示各组主动脉弓及头臂干处斑块

2.2各组血脂及MCP-1水平比较 由表1可知,两模型组在高脂饮食28 w后,血清TC、 LDL-C和TG水平均明显升高,分别和同年龄段对照组相比差异有统计学意义(P<0.01)。LC组血清 TG水平较QC组显著低(P<0.01),LM组血清 TG水平较QM组显著高(P<0.05)。LM组与QM组、LC组与QC组相比血清 HDL-C 有降低趋势,但差异无统计学意义(P>0.05)。与对照组相比,同年龄段模型组血清 MCP-1含量均明显升高(P<0.01);LC组与QC组相比,血清MCP-1水平显著低(P<0.01),QM组与LM组血清MCP-1水平无明显差异(P>0.05)。

2.3各组冠状动脉HE染色与油红O染色结果 HE染色结果显示,QC组血管管壁结构规则,内膜平滑、中膜厚度均一,管腔完整;LC组血管管壁较疏松,管腔较完整;QM组血管管壁部分结构凌乱、弹性膜结构破坏,管壁内可见AS斑块,其纤维帽完整;LM组冠状动脉管壁结构明显紊乱,管腔狭窄,弹性膜结构明显减少,内膜明显增厚。两对照组均无斑块形成,LM组较LC组主动脉根部水平斑块面积及脂质含量明显增大(均P<0.01)。油红O染色显示,与对照组相比,两年龄段模型组冠状动脉斑块中均有大量脂质沉积。LM组与QM组相比,冠状动脉斑块中斑块脂质含量少(P<0.05)。见图2、表2。

表2 各组斑块面积和斑块脂质含量比较

图2 各组冠状动脉形态

2.4两模型组冠状动脉斑块中胶原纤维含量、CD68、MMP9及出血点的表达差异 Masson染色显示两模型组冠状动脉斑块中均有大量胶原纤维沉积,且LM组较QM组冠状动脉斑块中胶原纤维含量百分比明显减少(P<0.05)。免疫组化染色显示,LM组冠状动脉斑块中CD68及MMP9含量与QM组相比显著增高(均P<0.01)。普鲁士蓝染色显示QM组冠状动脉斑块出血点百分比较LM组明显升高(P<0.01)。见表3、图3。

表3 两模型组冠状动脉斑块胶原纤维、CD68、MMP9含量和出血点比较

图3 两模型组冠状动脉Masson、CD68、MMP9和Perls染色(×400)

2.5各组主动脉组织中 ICAM-1 及 VCAM-1表达差异 与同年龄段对照组相比,LM组与QM组冠状动脉 ICAM-1、VCAM-1 mRNA及蛋白表达明显升高(P<0.01,P<0.05);ICAM-1和VCAM-1 mRNA表达在QM组与LM组、QC组与LC组之间差异有统计学意义(P<0.01,P<0.05)。ICAM-1蛋白表达在QM组与LM组之间差异有统计学意义(P<0.05),VCAM-1 蛋白表达在LM组与QM组间无统计学差异(P>0.05)。见表4、图4。

表4 各组主动脉ICAM-1、VCAM-1 mRNA和蛋白表达比较

图4 Western印迹检测各组主动脉ICAM-1、VCAM-1蛋白表达

3 讨 论

全球老年化人口在未来几十年中将大幅增长,预测到2050年,65岁以上的人数将翻一番,这提示与年龄有关疾病将出现不可避免的激增〔5〕。衰老被认为是一种慢性无菌低度炎症状态(也被称为炎症性衰老),在大多数慢性退行性疾病(包括老年性心血管疾病和脑血管疾病)的发展中起重要作用〔1〕。众多炎症细胞参与AS进程,而其中具有清道夫之称的单核/巨噬细胞更是参与了 AS 的全程,在AS早期阶段,其可通过摄取正常和氧化修饰性的脂蛋白减轻局部损害,但随着胞内脂质增多,其逐渐转化成泡沫细胞,单核/巨噬细胞原有细胞表型和功能也发生了改变〔6,7〕,本实验通过免疫组化对冠状动脉AS斑块内的巨噬细胞 CD68 进行定位定量分析,发现衰老对AS斑块内炎细胞的聚集有促进作用。MCP-1表达增多可诱导单核巨噬细胞、淋巴细胞等炎细胞向血管壁局部病变定向迁移、浸润及活化,活化的巨噬细胞可进一步分泌炎症因子促进AS 的进展,与冠心病密切相关〔8〕。本实验证实,MCP-1水平与 AS的形成密切相关,但在同等高脂饮食条件下不同年龄小鼠MCP-1 水平尚不足以形成显著差异。

ICAM-1和 VCAM-1 是介导炎细胞黏附的两个重要黏附分子。研究表明,ICAM-1、 VCAM-1等高表达促进巨噬细胞在斑块中大量增殖积累,增加斑块不稳定性〔9〕。研究发现,老年大鼠(24月龄)血清中的ICAM-1和VCAM-1都显著高于青年大鼠(6月龄),这表明这些黏附分子的系统性表达可能会增加炎症性血管疾病的风险〔10〕。本实验也证实,随着年龄增大,小鼠ICAM-1和VCAM-1 mRNA 表达增加,支持了 ICAM-1、VCAM-1 是参与AS 形成的主要事件之一的观点,但关于 VCAM-1 的年龄相关性变化仍不明确。Fotis等〔11〕研究证实,高胆固醇饮食可诱导 Wistar 大鼠主动脉中 ICAM-1 的表达增加,而对 AS 早期阶段 VCAM-1 的表达无明显影响,这提示主动脉中ICAM-1表达可能是AS病变的早期事件,而VCAM-1可能在AS后期表达,这也与实验结果相符,而LM组冠状动脉 VCAM-1 蛋白表达与LC组比有升高趋势,但无显著性差异,考虑与冠状动脉组织蛋白提取时混有部分心肌蛋白相关。

本研究还发现,老年模型组斑块中MMP9表达增高。研究表明,MMPs 在易损 AS 斑块进展中起着关键作用〔9〕,其中MMP9更是调节动脉细胞外基质含量的主要成分,其可降解细胞外基质,并促进平滑肌细胞的增殖和迁移〔12〕,其活性失衡可以导致血管的病理性改变。Masson染色结果与MMP9的结果相符合。结合HE 染色结果,本研究提示,斑块内脂质沉积与斑块大小呈正相关,且年龄对其有一定的促进作用。另发现,两模型组小鼠冠状动脉 AS 斑块内出血点密度有差异,但以青年模型组较多,即青年模型组小鼠较老年模型组小鼠冠状动脉 AS 斑块更易出血,但其原因仍不清楚,可能与血管新生的能力随年龄增加而减弱有关。

综上所述,老年与青年 ApoE-/-小鼠冠状动脉AS斑块组织形态学及稳定性相关指标存在差异,这表明在相同环境下,老年与青年ApoE-/-小鼠AS病变进程也并不完全相同。老年ApoE-/-小鼠AS斑块的不稳定性主要与内外膜炎症反应、细胞外基质降解有关,而青年 ApoE-/-小鼠AS斑块的不稳定性则主要与斑块内出血密切相关。至于斑块内出血在青年鼠冠状动脉AS斑块中更突出的原因尚有待进一步研究。