基于Sirt1通路研究白茅根提取物对心力衰竭大鼠心肌纤维化的干预作用

柳丽 梅葵 柳建

(六盘水市人民医院 1心血管内科,贵州 六盘水 553000;2内分泌科;3重症医学科)

心力衰竭指在多种致病因素作用下,心脏泵功能发生异常变化,导致心输出量绝对减少或相对不足,不能满足机体组织细胞代谢需要,患者有明显临床症状和体征的病理过程〔1～3〕。主要表现为呼吸困难、肺水肿、心源性休克和血流动力学障碍等。炎症反应、心肌组织心肌纤维化是导致心功能损伤,引起心力衰竭的主要原因〔4,5〕。白茅根具有抗炎、益气活血、阻止胶原蛋白合成等功能,能够减轻患者心力衰竭指标及炎症水平等,但作用机制尚不明确。心肌纤维化包括间质纤维化和心肌间质胶原沉积,属于多种不同的心脏疾病发展到一定时期时共同病理改变〔6,7〕。本研究分析白茅根取物对心力衰竭大鼠心肌纤维化的干预作用及对Sirt1信号通路的影响。

1 材料与方法

1.1材料 选取45只SD健康雄性大鼠(河南省疾病预防控制中心,使用许可证号:SYXK(豫)2017-0009),8～9周龄;体质量185～220 g,平均(197.5±10.0)g。在温度(22.0±2.6) ℃、湿度50%～55%环境中喂养1 w,正常饮水,规律光照12 h/d。主要试剂:取白茅根100 g,加水浸泡1 h,煮沸后煎30 min,过滤残渣再加水煎30 min后过滤合并两次过滤,经2 000 r/min,离心15 min。取上清液,浓缩至100 ml放置4 ℃冰箱保存。兔抗大鼠肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-6购自上海酶联生物研究所;兔抗人细胞沉默调节蛋白(Sirt)1、叉头转录因子(Fox)o1小鼠抗大鼠购自北京百奥莱科技有限公司;一抗兔抗鼠Ac-Foxo1购自艾美捷科技有限公司。

1.2建模及分组干预 正常组选取15只大鼠,其余30只建立心力衰竭大鼠心肌纤维化模型。模型组采用腹主动脉缩窄法建立舒张性心力衰竭(DHF)模型,用7号针头平行置于腹主动脉上,丝线扎紧后抽出针头,术后腹主动脉直径由1.0～1.2 mm减少至0.7 mm左右;正常组仅游离腹主动脉但不缩窄,其他操作与手术组相同。术后8 w,两组分别按完全随机分组法抽取3只大鼠通过超声心动图及心导管检测心脏舒张功能确立造模成功。建模过程中死亡2只,将剩余28只成模大鼠随机分为模型组和白茅根组各14只。正常组给予温生理盐水灌胃处理,10 ml/(kg·d);模型组和正常组接受等体积生理盐水灌胃处理;白茅根组给予白茅根汤处理10 ml/(kg·d),持续喂养8 w。

1.3HE 染色观察心肌组织形态 采集静脉血,2 000 r/min室温离心 10 min,取上清液置于-20 ℃冰箱中保存待用。立即处死大鼠,取心肌组织,部分置于 4%多聚甲醛中固定,部分置于-80 ℃冰箱中保存待用。取出多聚甲醛中固定的心肌组织,制备常规石蜡切片后每组取部分切片经脱蜡、水化处理后,苏木素染色,盐酸乙醇分化至返蓝,乙醇伊红复染后脱水,二甲苯透明,中性树胶封片,光学显微镜拍照。

1.4炎性因子水平检测 采用ELISA法检测血清TNF-α、IL-6及心肌组织中纤维连接蛋白(FN)水平,取包被液适当0.1 ml汉克平衡盐溶液(HBS)-lg稀释溶液加入含有聚苯乙烯反应板。加盖,放入4 ℃冰箱中,24 h,次日使用洗涤液洗涤,重复3次,甩干。将0.1 ml不同倍数血清加入每个孔中,同时将阳性和阴性对照血清加入,移去液体。洗涤,重复3次,甩干。再将每孔内加入0.1 ml辣根过氧化物酶(HRP)-抗体HBS-lgG,稀释,放置43 ℃温箱中60 min,移去液体,使用洗涤液洗涤,3次,甩干;将各个孔中注入0.1 ml底物液,避光放置20 min。再将各孔中加入0.05 ml 2 mol/L H2SO4终止反应。

1.5心肌纤维化指标检测 使用医学图像分析系统测量心肌纤维化相关指标,包括心肌血管周围胶原与管腔面积比例(PVCA)、左心室重量指数(LVMI)、心肌胶原体积比例(CVF)等指标,随机取每张心肌切片4个视野,取其平均值。

1.6心功能指标和血流动力学 采用无创血压测量系统读取左室舒张末期压(LVEDP)和左心室收缩压(LVSP)。

1.7Western印迹测定Sirt1、Ac-Foxo1、Foxo1通路蛋白表达量 检测心肌组织Sirt1、Ac-Foxo1、Foxo1蛋白表达水平,冰箱中取心肌组织,磨碎,蛋白提取试剂盒提取总蛋白,凝胶电泳分离蛋白质,转膜;5%脱脂奶粉恒温封闭2 h;对应加入一抗Sirt1(1∶10 000)、Foxo1(1∶500)、Ac-Foxo1(1∶250)、人磷酸苷油酸脱氢酶(GADPH,1∶10 000),4 ℃孵育过夜;加入对应二抗,室温孵育2 h。蛋白凝胶成像仪拍照和定量分析。

1.8统计学处理 采用SPSS19.0软件进行单因素方差分析、t检验。

2 结 果

2.1心肌组织HE染色 正常组心肌细胞排列整齐,肌原纤维完整,细胞核和细胞结构完整;模型组心肌纤维化,细胞形态不完整,心肌细胞增生性炎症浸润现象明显;白茅根组细胞排列较整齐、炎症现象降低。见图1。

图1 3组心肌组织(HE染色,×400)

2.2各组血清炎性因子水平比较 与正常组相比,模型组和白茅根组血清TNF-α、IL-6水平明显升高(P<0.05);与模型组相比,白茅根组血清TNF-α、IL-6水平明显降低(P<0.05)。见表1。

表1 各组血清炎性因子及心肌纤维化指标比较

2.3各组心肌纤维化指标水平比较 与正常组相比,模型组和白茅根组LVMI、PVCA、CVF指标水平明显升高(P<0.05);与模型组相比,白茅根组上述指标水平明显降低(P<0.05)。见表1。

2.4各组心功能指标和血流动力学的比较 与正常组相比,模型组LVEDP水平明显升高,LVSP水平明显下降(P<0.05);与模型组相比,白茅根组LVEDP水平明显降低,LVSP水平明显升高(P<0.05)。见表1。

2.5各组心肌组织Sirt1、Ac-Foxo1、Foxo1蛋白表达水平比较 与正常组相比,模型组和白茅根组Ac-Foxo1、Foxo1通路蛋白表达明显升高,Sirt1蛋白表达明显降低(P<0.05);与模型组相比,白茅根组上述指标差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2、图2。

表2 各组心功能指标水平、心肌组织Sirt1、Ac-Foxo1、Foxo1通路蛋白表达量比较

图2 各组心肌组织Sirt1通路蛋白表达

3 讨 论

心力衰竭是由于心排血量不足或心脏泵血功能受损功能发生障碍,导致心脏不能搏出同静脉回流及机体组织代谢所需的血液供应。心肌细胞减少是导致心肌功能障碍的关键因素〔8,9〕。因冠状动脉血管壁周围纤维增生和管壁增厚使冠脉循环储备和供血降低,进而促使心肌细胞死亡和纤维化,是难治性心力衰竭的病理基础,是心血管疾病的主要死亡原因。

心力衰竭与中医症候怔忡、水肿、心悸、痰饮、心痹等疾病相似,孙思邈《备急千金药房·脾脏脉论第一》中指出“心水者,身肿而少气,不得卧,烦而躁,其阴大肿,反瘦”,治疗上以益气温阳、益气养阴、益气活血、活血利水、活血化瘀为主。中医认为,白茅根性寒、味甘,可入肺经、胃经和膀胱经,具有凉血止血、清热利尿的作用。《本草纲目》中记载,白茅根可“止吐衄诸血、伤寒哕逆、肺热喘急、水肿黄疸、解酒毒”。研究发现,白茅根提取物具有镇痛抗炎、增强免疫功能、抑制毛细血管通透性增加、抗心肌缺血、降血压、可降低全血黏稠度、降低血细胞聚集性、改善血流变性从而起到抗血栓效果〔10,11〕。本研究结果表明,白茅根提取物能够调节心肌射血受损,对心肌组织起到保护的作用。

使用白茅根提取物治疗心力衰竭大鼠心肌纤维化,LVMI、PVCA、CVF指标水平较低,血清炎症TNF-α、IL-6水平下降,LVMI、PVCA、CVF水平升高,表现为基质沉积、纤维化现象越严重〔12,13〕。研究发现,心肌纤维化伴随炎症水平升高,IL-6、TNF-α作为炎症因子参与心肌细胞坏死过程,TNF-α可诱导IL-6释放,IL-6能加强组织细胞对TNF-α的敏感性〔14,15〕;IL-6可影响心肌收缩力,TNF-α可介导心肌重构和心肌收缩力。本研究提示,白茅根提取可减缓心肌纤维化、炎症损伤体征,对心肌起到保护作用。

Sirt1与多种信号传导通路中的蛋白和转录因子等蛋白相互作用参与神经保护、细胞衰老凋亡、糖脂代谢、炎症氧化应激反应等过程,发挥其对基因的调控功能和心血管的保护〔16,17〕。Sirt1水平降低使心肌细胞保护作用减弱是导致心功能病变的主要原因。Sirt1激活可抑制降低炎症因子IL-6、TNF-α水平,实现对脓毒症诱导的小鼠脑损伤。Foxo1是Foxo亚家族中发现最早的转录因子,在机体细胞增殖、凋亡、抵抗氧化应激等方面发挥重要作用〔18,19〕。Sirt1通过调节Foxo1蛋白去乙酰化作用,去乙酰化,转录活性减弱,进而参与疾病的发生使Foxo1与DNA结合促进其转录活性。Foxo1的水平能够调控与骨骼肌萎缩相关蛋白,从而加重慢性心力衰竭导致的骨骼肌萎缩现象。研究指出,Foxo1介导途径能够改善高脂饮食诱导的非酒精性脂肪肝疾病中以胶原蛋白沉积和纤维化蛋白表达形式出现的肝纤维化〔20,21〕。