丹参酮ⅡA对高糖诱导的胰岛β细胞存活、凋亡及胰岛素分泌的影响及其潜在分子机制

李文静 郝翠翠 杨超

(聊城市第二人民医院内分泌科,山东 聊城 252600)

糖尿病是以高血糖为特征的全身代谢性疾病,胰岛β细胞功能受损、胰岛素分泌不足,导致血糖升高,是糖尿病发病的重要病理生理基础,而长期高血糖将对胰岛β细胞功能造成不可逆转的损伤〔1～3〕。因此保护胰岛β细胞功能和数量对控制机体血糖稳定至关重要。丹参酮ⅡA是丹参干燥根茎的脂溶性活性成分,已有研究表明,丹参酮ⅡA对糖尿病及其并发症具有显著疗效〔4,5〕。然而,目前丹参酮ⅡA对高糖状态下胰岛β细胞功能损伤的影响尚不清楚。本研究观察不同浓度丹参酮ⅡA对高糖状态下胰岛β细胞存活、凋亡和胰岛素分泌的影响及其潜在分子机制。

1 材料和方法

1.1实验材料 胰岛β细胞株INS-1(中科院上海细胞库);丹参酮ⅡA(美国Sigma公司);DMEM正常糖培养基和高糖培养基(美国Invitrogen公司);胎牛血清(北京索莱宝生物公司);Lipofectamine 3000转染试剂〔赛默飞世尔科技(中国)有限公司〕;CCK8试剂盒(北京沃比森科技有限公司);膜联蛋白Ⅴ-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶(Annexin Ⅴ-FITC/PI)细胞凋亡检测试剂盒(上海贝博生物公司);胰岛素酶联免疫分析试剂盒(北京索莱宝生物公司);Trizol试剂(美国Invitrogen公司);RIPA裂解液(上海碧云天生物技术有限公司)。

1.2细胞培养及转染 将冷冻的INS-1细胞放入37 ℃水浴锅中融化,完全融化后在无菌超净工作台中吸出细胞悬液至新的无菌离心管中,加入适量含10%胎牛血清的DMEM培养液,吸打混匀后,离心,弃上清,重悬,将细胞悬液接种于含10%胎牛血清的DMEM培养液中,置于37 ℃,5%CO2的培养箱中培养。培养至细胞汇合达90%左右,弃去培养液,加入0.25%胰蛋白酶消化细胞,进行传代培养。取处于对数生长期的INS-1细胞,参照Lipofectamine 3000转染试剂说明书,分别将慢病毒过表达空载体(Lv-NC)、慢病毒circ_0056891过表达载体(Lv-circ_0056891)、小干扰RNA(siRNA)阴性对照(si-NC)、siRNA circ_0056891(si-circ_0056891)转染至细胞,转染后48 h用于后续实验。

1.3细胞分组处理 将INS-1细胞以5×104个/孔接种于96孔板中,并随机分组,正常糖组:培养液中葡萄糖浓度为5.5 mmol/L;高糖组:培养液中葡萄糖浓度为30 mmol/L;高糖+丹参酮ⅡA组:培养液中含有葡萄糖终浓度30 mmol/L和丹参酮ⅡA终浓度10、20、40 μmol/ml;高糖+Lv-NC组:转染Lv-NC的细胞在葡萄糖浓度为30 mmol/L的培养液培养;高糖+Lv-circ_0056891组:转染Lv-circ_0056891的细胞在葡萄糖浓度为30 mmol/L的培养液培养;高糖+丹参酮ⅡA+si-NC:转染si-NC的细胞在葡萄糖浓度为30 mmol/L和丹参酮ⅡA浓度为40 μmol/ml的培养液培养;高糖组+丹参酮ⅡA +si-circ_0056891:转染si-circ_0056891的细胞在葡萄糖浓度为30 mmol/L和丹参酮ⅡA浓度为40 μmol/ml的培养液中培养。

1.4CCK8实验检测细胞存活 将INS-1细胞以1×105个/孔的密度接种于96孔板中,常规培养24 h后,更换无血清的培养液饥饿培养24 h,然后按上述分组,更换相应培养液培养48 h。每孔加入CCK8溶液10 μl,孵育2h后,酶标仪测定每孔450 nm处吸光度值(A值)。细胞存活率(%)=(药物组A值-空白组A值)/(对照组A值-空白组A值)。

1.5流式细胞仪检测细胞凋亡 按1.3中描述的方法处理INS-1细胞,并收集各组细胞,预冷的PBS洗涤细胞2次,参照Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒,使用1×结合绘冲液重悬细胞,将细胞悬液转移至流式管中,分别加入5 μl Annexin V-FITc和5 μl PI轻轻混匀,避光孵育10 min,流式细胞仪上机检测细胞凋亡情况。

1.6酶联免疫吸附试验(ELISA)检测胰岛素分泌 使用胰岛素酶联免疫分析试剂盒检测处理后INS-1细胞胰岛素分泌。

1.7实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测circ_0056891的表达 采用Trizol法提取细胞总RNA,紫外分光光度法检测RNA样品OD260/OD280比值为1.8～2.0,1.5%琼脂糖凝胶检测RNA样品没有降解,可用于后续实验。使用逆转录试剂盒将RNA样品转录合成cDNA,以cDNA为模板进行荧光定量PCR,反应程序:95 ℃预变性30 s;95 ℃、5 s,60 ℃、30 s,40个循环。结果以GAPDH为内参,采用2-ΔΔCt法计算circ_0056891及p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT mRNA的相对表达水平。

1.8Western印迹检测p-PI3K和p-AKT蛋白表达 采用RIPA裂解法提取细胞总蛋白,二喹啉甲酸(BCA)法检测蛋白样品浓度,取蛋白样品放入100 ℃沸水中变性10 min,然后用于十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离目的蛋白。转膜至聚偏氟乙烯(PVDF)膜,将膜放入封闭液中封闭2 h,Tris盐酸缓冲液吐温(TBST)冲洗,加入稀释后的一抗中,4 ℃孵育过夜,TBST冲洗后,加入稀释后的二抗中,室温孵育2 h,TBST冲洗。将膜放入发光液中显色,凝胶成像系统下曝光、拍照。使用ImageJ软件分析目的蛋白灰度值。

1.9统计学分析 采用SPSS19.0软件进行单因素方差分析、SNK-q检验。

2 结 果

2.1丹参酮ⅡA对高糖诱导的INS-1细胞存活、凋亡和胰岛素分泌的影响 与正常糖组比较,高糖组细胞存活率明显降低,细胞凋亡率及胰岛素分泌明显升高(P<0.05);与高糖组比较,高糖+丹参酮ⅡA各剂量组细胞存活率及胰岛素分泌明显升高,细胞凋亡率明显降低(P<0.05)。见图1、表1。

表1 各组细胞存活、凋亡和胰岛素分泌和circ_0056891相对表达量比较

图1 流式细胞术检测各组细胞凋亡

2.2丹参酮ⅡA对高糖诱导的INS-1细胞中circ_0056891表达的影响 与正常糖组比较,高糖组细胞中circ_0056891相对表达水平明显降低(P<0.05);与高糖组比较,高糖+丹参酮ⅡA各剂量组细胞中circ_0056891相对表达水平明显升高(P<0.05),且丹参酮ⅡA浓度越高,circ_0056891相对表达水平越高。见表1。

2.3过表达circ_0056891对高糖诱导的INS-1细胞存活、凋亡和胰岛素分泌的影响 与正常糖组比较,高糖组细胞存活率明显降低,细胞凋亡率及胰岛素分泌明显升高(P<0.05);与高糖+Lv-NC组比较,高糖+Lv-circ_0056891细胞存活率及胰岛素分泌明显升高,细胞凋亡率明显降低(P<0.05)。见表2。

表2 过表达circ_0056891对高糖诱导的INS-1细胞增殖、凋亡和胰岛素分泌的影响

2.4丹参酮ⅡA调控circ_0056891对INS-1细胞中PI3K/AKT信号通路的影响 与正常糖组比较,高糖组细胞中p-PI3K和p-AKT mRNA及蛋白相对表达均明显降低(P<0.05);与高糖组比较,高糖+丹参酮ⅡA组细胞中p-PI3K和p-AKT mRNA及蛋白相对表达均明显升高(P<0.05);与高糖+丹参酮ⅡA+si-NC组比较,高糖组+丹参酮ⅡA +si-circ_0056891组细胞中p-PI3K和p-AKT mRNA及蛋白相对表达均明显降低(P<0.05)。见图2、表3。

表3 各组细胞存活、凋亡和胰岛素分泌和p-PI3K、p-AKT mRNA蛋白相对表达比较

1～5:正常糖组、高糖组、高糖+丹参酮ⅡA组、高糖+丹参酮ⅡA+si-NC组、高糖组+丹参酮ⅡA+si-circ_0056891组

2.5敲减circ_0056891逆转丹参酮ⅡA对高糖下INS-1细胞存活、凋亡和胰岛素分泌的影响 与高糖组比较,高糖+丹参酮ⅡA组细胞存活率及胰岛素分泌明显升高,细胞凋亡率明显降低(P<0.05);与高糖+丹参酮ⅡA +si-NC组比较,高糖组+丹参酮ⅡA +si-circ_0056891组细胞存活率及胰岛素分泌明显降低,细胞凋亡率明显升高(P<0.05)。见表3。

3 讨 论

丹参酮ⅡA是丹参中最活跃的一类脂溶性成分,具有抗炎、抗氧化等多种生物活性〔6〕。研究表明,丹参酮ⅡA能够减轻糖尿病大鼠肾组织病理损伤,保护肾组织;减轻糖尿病大鼠冠状动脉组织病变,抑制血管炎症;还可以显著降低糖尿病大鼠周围神经细胞凋亡,抑制周围神经病变〔7～10〕。胰岛β细胞的主要作用是分泌胰岛素,调节机体血糖含量,但随着糖尿病的发展,胰岛β细胞失代偿可导致血糖持续升高,进而刺激胰岛β细胞发生不可逆的损伤乃至衰竭〔11,12,3〕。本研究结果提示,丹参酮ⅡA能够有效促进高糖刺激下INS-1细胞的存活,抑制高糖诱导的细胞凋亡,有效促进高糖状态下INS-1细胞的胰岛素分泌。

环状RNA(circRNA)是一种内源性非编码RNA,研究表明,circRNA广泛参与细胞内基因表达调控,与神经性疾病、动脉粥样硬化性疾病、癌症、炎症等多种疾病的发生及发展密切相关〔13,14〕。研究表明〔15～17〕,circRNA在糖尿病发病、进展、疾病诊断及治疗等方面均具有重要作用,可参与糖尿病下β细胞功能障碍的调节。circ_0056891是一种糖尿病相关的circRNA,在2型糖尿病中低表达,可增加糖尿病的患病风险,且对糖尿病具有一定诊断价值〔18〕。但circ_0056891在胰岛β细胞中的表达和作用尚不可知。本研究结果表明,高糖刺激下INS-1细胞中circ_0056891表达降低,而丹参酮ⅡA处理可以上调高糖状态下INS-1细胞中circ_0056891的表达,抑制circ_0056891后逆转了丹参酮ⅡA对高糖下INS-1细胞功能的保护作用。提示丹参酮ⅡA可能通过上调circ_0056891减轻高糖对INS-1细胞的损伤。

PI3K/AKT信号通路参与细胞增殖、凋亡、分化和葡萄糖转运等多种细胞功能的调节〔19〕。研究表明,PI3K/AKT信号通路是胰岛素效应组织调节葡萄糖稳态的关键通路之一,激活PI3K/AKT信号通路可以拮抗脂多糖(LPS)诱导的胰岛β细胞凋亡和胰岛素分泌障碍,还可保护2型糖尿病胰岛β细胞,是改善糖尿病胰岛素抵抗的有效途径〔20～22〕。本研究结果提示,上调circ_0056891/PI3K/AKT信号通路可能是丹参酮ⅡA保护INS-1细胞免受高糖刺激损伤的潜在分子机制。

综上,丹参酮ⅡA能够促进高糖状态下INS-1细胞的存活,抑制细胞凋亡,并促进细胞胰岛素分泌,其作用机制是上调circ_0056891的表达,进而激活PI3K/AKT信号通路。