α-突触核蛋白在帕金森病铁死亡中作用的研究进展

张利杰 逯冉冉 郝梦蝶 杨新玲

(新疆医科大学第二附属医院神经内科,新疆 乌鲁木齐 830000)

帕金森病(PD)是一种常见的神经退行性疾病,其特征是运动障碍及非运动症状。在PD病理生理中,主要表现为多巴胺能神经元的死亡和细胞内α-突触核蛋白(α-syn)的聚集、铁累积、氧化应激升高和脂质过氧化等〔1〕。然而,潜在的机制仍不清楚。铁死亡是一种铁依赖的新型细胞死亡方式,涉及脂质过氧化物的致死累积,在PD发病中存在共性〔2〕。而PD病理核心致病蛋白α-syn在功能上与铁和脂质代谢有关,提示α-syn失调与PD病理特征之间存在相互作用。本文对铁和α-syn之间的相关性及靶向抑制铁死亡在PD体内外模型中的保护作用进行综述。

1 铁死亡与PD的相关性

铁死亡这一概念在2012年被提出,是一种铁依赖的脂质过氧化的新型细胞死亡方式。铁死亡在PD体内、体外模型中均已被证明〔3〕。在铁死亡诱导剂Erastin诱导多巴胺能神经元中脑细胞铁死亡时发现可被铁死亡特异性抑制剂Fer-1和铁螯合剂DFP阻断。同时这些特异性抑制剂还可防止纹状体黑质多巴胺能神经元的丢失和缓解运动障碍等〔4〕。α-syn聚集形成Lewy小体,长期以来一直被认为是PD发病的关键病理特征。全基因组关联研究证实了α-syn与PD的病理学关系,确认了SNAC基因(负责编码α-syn)的突变导致了从经典型到早发家族性PD的各种临床表现〔5〕。尽管α-syn参与PD的病理过程,但其确切的生理功能及在神经退行性变疾病中的机制仍不明确。在近期的研究中,发现α-syn在铁死亡铁和脂质代谢过程中存在关联性,铁螯合剂和铁抑制剂能够抑制α-syn寡聚体诱导的细胞死亡〔6〕。

2 铁与α-syn的相关性

2.1铁与α-syn之间的结构联系 在PD病理学标志物中,α-syn是Lewy小体的主要构成成分。有研究证明α-syn上含有铁离子的结合位点,在暴露于高铁环境下,神经元胞内的α-syn过度表达及增高铁含量。同时,铁可引起α-syn蛋白聚集体及纤维体的形成,诱导构象发生改变,增加致病毒性〔7〕。在分子水平上,二价铁优先结合于α-syn的C端,尽管结合的不是很牢。在核磁共振谱中α-syn的C端残基Asp121、Asn122、Glu123受到严重的影响,证实这些位点具有较高的亲和力〔8〕。等温滴定量热法(ITC)显示三价铁在α-syn上存在一个单一的结合位点〔9〕。研究表明,α-syn除在C端存在结合位点外,在有氧条件下二价铁离子可促使α-syn的N端乙酰化形成低聚物〔10〕。综上所述,铁离子和α-syn的直接结合和随后的结构重组在很大程度上提示铁离子和α-syn的聚集存在关联性。

2.2铁对α-syn转录后的调控 铁离子在体内的稳态主要是由铁调节蛋白(IRPs)调控,一种RNA结合蛋白。IRP1和IRP2是铁的关键感受器分子,在结构和功能是上同源的,共同参与铁代谢转录后的调控〔11〕。IRP1和IRP2通过与铁反应元件(IRE)的非翻译区(UTR)结合,调控铁的摄入、转运、存储和释放的转录后过程。这些含有IRE的mRNAs包括转铁蛋白受体(TfR)1、铁蛋白、铁转运蛋白(FPN)1等〔12〕。 当细胞内高铁形成Fe-S簇时,可阻碍IRP1与IRE结合,降低胞内铁含量。而IRP2的调节主要受到铁介导的蛋白酶体降解。相反,细胞内铁离子含量减少时,IRP1和IRP2与TfR1 mRNA的3′UTR的IREs结合,促使TfR1 mRNA稳定性增高,加速蛋白质的翻译,增高胞内铁离子的含量〔13〕。

α-syn的mRNA的5 '-UTR中的46个碱基对形成一个单一的RNA环,这个结构与H-ferritin、L-ferritin、FPN1、红系5-氨基乙酰丙酸(eALAS)和线粒体乌头酸酶的mRNA的5 '-UTR中的IREs相似〔14〕。α-syn的5 '-UTR区域内包含的IRE参与神经元铁代谢相关的蛋白质的翻译过程。在一项体外高铁实验中,敲除SK-N-SH细胞的IRP1,α-syn的mRNA水平上调,证实铁离子可促进α-syn表达及加速聚集物的形成〔15〕。在HEK293细胞中,铁螯合剂去铁胺(DFO)可降低α-syn的mRNA水平,证明铁可以调控α-syn转录后的水平〔16〕。在体内实验中,DFO可有效降低PD模型中的α-syn的量,从而减轻病理性α-syn的聚集作用。迷迭香酸预处理可通过降低IRP1蛋白水平降低α-syn的mRNA的水平,抑制铁诱导的α-syn的聚集〔17〕。推测阻断铁离子调节的α-syn的转录过程可能是改善铁和α-syn引起的病理的关键策略。

2.3铁对α-syn的翻译后修饰 近年来发现α-syn在翻译时主要包括乙酰化、泛素化、糖基化、硝基化及磷酸化等,这些翻译后的修饰可能与病理性聚集相关。例如,糖基化可影响α-syn的N末端,阻碍α-syn的清除,促进有毒低聚物的积累,而使用糖基化抑制剂可以重建正常的α-syn的清除过程,减少聚集〔18〕。

病理研究发现,在Lewy小体中,磷酸化的α-syn约占90%以上,而在生理条件下,只有4%的可溶性单体α-syn被磷酸化。α-syn在酪氨酸、苏氨酸和丝氨酸残基(如Tyr125、Ser87和Ser129)上存在磷酸化位点〔7〕。Ser129的磷酸化是α-syn翻译后的主要修饰。而Lewy小体中α-syn的Ser129位点的磷酸化修饰可能与多巴胺能神经元退行性变密切相关。在近期研究中,脑脊液和血浆中均能检测到Ser129位点磷酸化的α-syn,可被认为是一种PD的生物学标志物〔19〕。此外,在肠神经系统中也可被检测到。在一个转基因A53T突变小鼠中,发现ser129 磷酸化的α-syn在运动障碍发生前可在肠神经系统中早期积累并持续存在。在特发性快速动眼睡眠障碍(RBD)患者的结肠活检中,发现在黏膜下神经纤维中存在ser129 磷酸化的α-syn〔20〕。这些证据表明,结肠活检可以作为PD诊断的前驱标志物。因此,α-syn翻译的磷酸化在PD致病中扮演者重要的角色,阻止α-syn的磷酸化过程有助于预防PD的发生。

在α-syn的ser129磷酸化过程中,主要参与的酶包括polo样激酶(PLKs)、G蛋白耦联受体激酶(GRKs)、酪蛋白激酶(CKs)和富亮氨酸重复激酶(LRRK)2等。在过表达α-syn和PLK2的细胞中,α-syn早期出现磷酸化并引起错误折叠和形成聚集体。α-syn磷酸化增强胞内囊泡膜的破坏,使错误折叠的α-syn从胞外转移至胞内并促进细胞间α-syn增殖〔21〕。在GRK6介导的α-syn磷酸化中可显著增加神经毒性,形成不可溶的α-syn及显著增加多巴胺能神经元的变性。然而在一些实验中未能得到证实,α-syn的磷酸化并不能加剧病情的发展〔22〕。在PD大鼠模型中,PLK2介导α-syn的Ser129位点的磷酸化可以抑制α-syn的毒性,并增强PLK2/α-syn复合物的降解。故有人提出在这些研究中的差异可能是由于不同的激酶在不同模型中磷酸化Ser129或其他残基的效率不同〔23〕。总的来说,关于α-syn磷酸化是否能够促进聚集及神经毒性或神经保护作用还有待于进一步讨论。

铁离子介导的翻译后修饰是基于铁源性的氧化损伤促进的磷酸化修饰,而磷酸化可促进PD中α-syn的聚集和神经毒性。在暴露于高铁的细胞中,铁离子可引起α-syn低聚体、包裹体及ser129磷酸化单体的聚集〔19〕。在此过程中,铁可促使氧化物的堆积,促进CK2的积累,GRK2的减少。这表明铁离子引起磷酸化的α-syn聚集是CK2上调的结果〔21〕。在高铁SH-SY5Y细胞中,铁离子促进脂质过氧化物形成和改变线粒体的形态及降低蛋白磷酸酶(PP)2A的活性。在近期研究中表明,铁离子引起磷酸化α-syn的聚集是由于CK2和PLK2上调所致。透射电子显微镜(TEM)在监测α-syn的聚集时,发现三价铁可改变α-syn原纤维的形态,加速野生和突变类型的产生〔24〕。在α-syn中加入铁会引起低聚体的形成从而增加神经毒性。Ser129或Tyr125位点的磷酸化可通过增加α-syn的C端残基对二价铁的亲和力,改变结合位点。综上,铁离子引起的磷酸化可促进α-syn的聚集及增强神经毒性。

2.4铁参与α-syn的降解 生理情况下,α-syn的形成和降解存在一定的平衡。泛素-蛋白酶系统(UPS)和自噬-溶酶体途径(ALP)主要是胞内降解α-syn的蛋白水解系统。研究表明α-syn在胞内的聚集及细胞毒性所导致的神经退行性变主要是因为这两种蛋白水解系统的失调〔25〕。铁沉积可以直接改变α-syn的结构,也可以通过改变转录和翻译后的修饰。

近期研究表明,铁可通过调节蛋白水解途径参与α-syn的降解过程。DFO耗尽铁离子诱导自噬,促进溶酶体中铁蛋白的降解。自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤存在时,蛋白酶体中发生铁蛋白的降解,说明UPS和ALP受到细胞内铁的调节〔26〕。结构异常或功能失调的铁蛋白可能是PD自噬损伤和铁稳态障碍之间的联系。自噬障碍可影响铁蛋白的选择性自噬,进而导致铁代谢的异常。铁诱导的氧化应激导致α-syn聚集体的形成和生成ROS诱导SH-SY5Y细胞自噬。因此,铁螯合剂可通过去除自噬的过氧化毒性保护细胞。在过表达DMT1引起摄铁增多时,可观察到SH-SY5Y细胞出现过度的自噬活动,且自噬抑制剂可逆转这一现象〔27〕。在原代神经元中,二价铁可显著降低自噬相关蛋白Beclin1、Atg5蛋白水平和自噬体数量,提示自噬通路受损。雷帕霉素是一种自噬激活剂,可逆转铁诱导的神经元α-syn聚集。沉默α-syn对铁诱导的自噬抑制没有影响,进一步证明铁主要破坏自噬〔28〕。因此,ALP和UPS不仅参与α-syn降解,还通过铁蛋白降解参与铁的循环利用。综上,PD中的铁积累和α-syn聚集可能与降解信号通路有关。

3 PD靶向铁死亡的治疗进展

目前PD的治疗中,主要以药物为主延缓疾病的进展,但不少患者存在对药物耐受或不敏感。在PD细胞和动物模型中已被多次证实铁螯合剂的使用可以改善细胞铁死亡及动物运动障碍等症状。而并非所有的铁螯合剂都可应用于PD患者,对于有临床价值的铁螯合剂必须能够特异性进入大脑,同时要避免对其他部位的铁清除〔29〕。铁螯合剂去铁酮(DFP)具有跨膜的特性,能够穿透血脑屏障和螯合脑组织中神经元内的铁离子,且不引起贫血的发生。而DFP这种特性归功于可将螯合的铁离子重新分布至胞外,有利于铁离子的清除和重新部署,目前已进入二期临床试验阶段〔30〕。

同时,消除由铁离子引起的脂质过氧化物的堆积也是一种新兴的治疗策略。肌肽是一种内源性组氨酸二肽,可耦联脂质过氧化物以提供抗氧化损伤的保护作用。在PD体外6-OHDA模型中,肌肽可以减少神经元细胞的死亡和ROS生成。而在PD小鼠模型中也被证明鼻内注射肌肽可减少黑质中α-syn的积累和运动功能〔31〕。在一项临床试验中,肌肽可以提高PD患者初期治疗的有效性,降低UPDRS评分,恢复超氧化物歧化酶(SOD)的水平。在靶向抗氧化防御方面,越来越多研究证明其有效性和安全性〔32〕。一些二期临床试验证实补充CoQ10可有效缓解PD的运动症状,而一些临床试验却没有显著的效益。

综上,随着在PD背景下探讨铁离子和α-syn的相关性,我们对铁死亡在PD中有了更深入的了解,包括铁离子在α-syn中转录、翻译及翻译后的调控高度系统的整合。更重要的是,在PD患者身上应用驱铁药物的临床试验正在进行中,后续仍需收集大量数据进一步探讨有效性及安全性。此外,为了明确靶向铁死亡的候选药物的治疗效果,我们还需在铁死亡特异性蛋白上寻找新的药效学生物标志物。因此,在PD发病机制这一领域将不可避免的进一步阐明铁死亡的生理和病理作用,从而为包括PD在内的神经退行性疾病提供新的治疗策略。