腹膜透析致腹膜损伤与线粒体功能障碍诱导自噬的相关性

刘前程 刘鑫 杨端云 吴敏华 邓湘雨 钟文露 孟立锋,2

(1广西中医药大学,广西 南宁 530023;2广西中医药大学第一附属医院肾内科)

腹膜透析(PD)是终末期肾脏病患者重要的肾脏替代治疗方法之一,全球透析人口中有11%在PD〔1〕。与血透相比,PD成本更低,更有利于残余肾功能的保护,但是PD并不能完全替代人体正常肾脏功能,患者进行PD的1～4年内仍有3%～36%的患者出现腹膜损伤、腹膜纤维化(PF)致腹膜超滤功能衰竭,患者不得不退出PD。PF的始动环节是腹膜间皮细胞(PMC)损伤。因此,针对性干预PMC损伤是防治PF的重要靶点,开发保护PMC损伤的技术或药物成为研究的重要课题。

线粒体损伤、功能障碍可以引起细胞供能障碍,最终导致细胞死亡。线粒体自噬可以清除损伤、功能障碍的线粒体,从而维持机体细胞的存活。线粒体损伤、功能障碍是引起自噬发生的主要原因之一。有报道指出,高糖腹膜透析液(PDS)能抑制线粒体呼吸链复合物Ⅲ及抗氧化物酶活性,进而导致PMC层通透性增高,引起PMC损伤〔2〕。研究发现PINK1/Parkin通路调控线粒体自噬,对于线粒体的数量控制、质量控制及正常功能的维持起到重要作用〔3〕。针对性干预PINK1/Parkin通路调控线粒体自噬可能是防治PMC发生的重要靶点。

PD尿毒症患者的全身微炎症、氧化应激状态、反复发作的腹膜炎症等是导致患者腹膜损伤的重要原因,目前临床尚缺乏有效的防治措施。脾气亏虚是PD相关腹膜早期病变的主要病机,而PMC损伤又是PF的起始环节,脾胃是人体气血生化之源,线粒体是细胞的动力工厂。在中医药理论指导下,结合现代医学对PMC损伤的机制认识,从脾胃着手干预PMC线粒体功能障碍防治PDS诱导的PMC损伤,体现了中医病证结合的辨治特色。研究表明〔4〕,具有健脾益气功效的中药单体如黄芪甲苷、葛根素等可能具有干预细胞线粒体损伤、功能障碍,进而防治PMC损伤、PF的作用。在目前尚未开发出有效保护腹膜结构和功能药物(包括新型透析液)的情况下,积极探索中医药防治PF、保护腹膜功能的有效干预方法及可能作用机制,对于预防治疗PF、延长PD患者的腹透时间、提高其生存率具有重要的科学意义和社会意义。

1 PMC损伤是PF的始动因素

研究表明〔5〕,保持腹膜结构的完整性和功能的有效性,尿毒症患者才能够长期、有效地进行PD。而PMC是机体腹膜的主要组成部分,保护PMC不受非生理相容性腹透液、炎症反应、氧化应激损伤,有助于维持腹膜正常结构和功能。然而,长期PD过程中,腹膜长时间与高糖、高渗、低酸碱(pH)值等非生理相容的PDS接触及反复发生的腹膜炎和腹腔积血等均可引起腹膜慢性炎症及损伤,这些因素均会对腹腔的局部防御功能及腹膜的细胞成分造成损害,导致PMC出现间充质转分化(EMT)、新生血管形成等病理表现,从而引起腹膜结构和功能的变化,促进了PF的形成,最终导致腹膜超滤功能衰竭〔6〕。因此,PMC损伤是PF的始动因素,针对PMC损伤这个起始环节进行防治PF的研究,体现了中医学既病防变的理念〔7〕。

高浓度葡萄糖PDS破坏了PMC结构,是导致PF的重要因素。尽管新型PDS不断涌现,但是基于葡萄糖的传统透析液仍然是绝大多数PD患者的首选,在含糖腹透液的长期作用下,PMC脱落、缺失,基质金属蛋白酶(MMPs)等基质降解酶的产生减少,MMPs及其抑制剂平衡被破坏,抑制细胞外基质的降解;同时增加纤维连接蛋白、活化蛋白的表达,促进PF〔8〕。有研究报道,高糖PDS对腹膜组织毒性作用早期体现在诱导细胞氧化损伤和线粒体功能障碍〔9〕。首先,高糖PDS能够诱导PMC内细胞活性氧(ROS)生成引起腹膜组织氧化应激损伤〔9〕。其次,生成的ROS促进了巨噬细胞极化,加重PMC损伤〔10〕,最终诱导腹膜炎症反应、PMC发生EMT〔11〕。

2 线粒体功能障碍是高糖PDS诱导PMC损伤的主要机制

线粒体功能障碍可表现为三磷酸腺苷(ATP)合成减少、ROS生成增加、线粒体膜通透性转换孔开放等,是介导细胞凋亡、坏死的重要因素〔12〕。研究表明,线粒体功能障碍通过损伤足细胞、肾小管上皮细胞及内皮细胞介导肾脏疾病〔13〕。此外,报道指出线粒体功能障碍在神经退行性变、糖尿病等疾病过程中也具有重要作用〔14～16〕。

首先,线粒体功能障碍是PMC损伤的早期事件,可直接介导PMC凋亡。研究表明,在高糖PDS及其反应产物反复刺激下,PMC的ROS生成增多,清除相对不足,从而导致了细胞线粒体功能障碍、氧化应激和PMC凋亡,加速了PD尿毒症患者的腹膜损伤、通透性改变的进程,最终导致腹膜超滤衰竭〔17,18〕。机体清除ROS、维持线粒体动态和能量代谢平衡、保护细胞存活的主要途径为线粒体自噬。研究表明,高糖PDS可导致PMC线粒体损伤,进而导致线粒体自噬受阻,ROS积累越来越多,最终导致细胞凋亡坏死〔19〕。其次,高糖PDS还可能通过抑制过氧化物酶体增殖活化γ辅助活化因子(PGC)-1α蛋白的表达,抑制线粒体呼吸链活性及抗氧化物酶活性,促进ROS积聚,诱导细胞凋亡〔2〕。此外,PMC在高糖PDS长期作用下炎症因子分泌增多,导致细胞长期处于慢性微炎症状态,从而启动新生血管的形成及PF过程〔20〕。最后,高糖PDS还可持续激活PMC核苷酸结合寡聚化结构域样受体(NLRP)3-白细胞介素(IL)-1β,实时启动线粒体自噬可能干预NLRP3-IL-1β持续激活,这可能成为延缓PD腹腔慢性炎症及PF的治疗靶点〔21〕。

综上,高糖PDS造成腹膜线粒体损伤、功能障碍是PMC损伤的主要机制。线粒体自噬可清除受损的线粒体,缓解线粒体功能障碍,进而防治PMC损伤。因此,研究线粒体损伤、功能障碍在PF发生、发展中的具体作用,可以为阐明PF的发病机制及其临床防治提供新思路。

3 PINK1/Parkin途径依赖的线粒体自噬是防治PMC损伤的重要靶点

线粒体自噬在机体维持线粒体稳态及功能中起到主要作用。线粒体损伤后,通过调节自噬小体特异性吞噬、降解和清除受损的线粒体,在维持线粒体功能和细胞存活中起到重要作用。适度水平的线粒体自噬有利于维持能量供应及细胞功能,对于细胞的新陈代谢及细胞凋亡等过程具有重要作用。然而,过度的线粒体自噬加重线粒体功能障碍,导致细胞死亡。

线粒体自噬的机制主要有Parkin依赖性及Parkin非依赖性,包括Parkin与PINK1介导的、线粒体自噬受体蛋白(FUNDC1)参与的缺氧介导的及腺病毒E1B相互作用蛋白(Bnip)3/Nip样蛋白(Nix)介导的〔22〕。研究表明,Parkin依赖性的PINK1、Parkin及泛素协同在线粒体正常功能的维持、自噬的调控中起到主导作用〔3,23〕。PINK1被认为是线粒体损伤的主要探测器,Parkin被认为线粒体自噬信号的“增强子”,起到放大信号等重要作用〔24〕。生理状态下,PINK1及Parkin都维持稳定的低水平状态。当线粒体受损时,负责降解PINK1的蛋白水解酶被抑制,PINK1在受损线粒体外膜聚集并诱导Parkin转位到受损线粒体〔25〕。与此同时,Parkin的构象发生变化,其E3泛素酶被激活,从而线粒体基质蛋白泛素化,泛素化的自噬受体蛋白P62在去极化的线粒体基质上积累,进而与微管相关蛋白1A/1B-轻链(LC)3结合,介导泛素化的底物进入自噬体,募集受损线粒体到溶酶体上,从而介导线粒体自噬的发生。PINK1/Parkin信号通路蛋白PINK1和Parkin是调节线粒体自噬的关键蛋白,其表达水平的高低可以反映线粒体自噬水平的高低。

细胞内稳态、运动和死亡等多种细胞程序进程都有线粒体自噬的参与。因此,明确PMC线粒体功能变化与自噬的关系及线粒体自噬相关分子机制,将成为高糖PDS诱导PMC损伤的突破口。有研究表明,PMC能抑制线粒体呼吸链复合物Ⅲ活性,进而导致PMC层通透性增高,引起PMC损伤〔2〕。新的研究表明PINK1/Parkin通路介导的线粒体自噬可缓解高血压脑出血后脑损伤程度〔26〕。因此推测PINK1/Parkin通路介导的线粒体自噬可能是高糖PDS诱导PMC损伤发生的主要机制。调控PINK1/Parkin通路影响PMC线粒体功能及其介导的自噬活性,激活其适应性保护机制,可能是保护PMC损伤、防治PF的新靶点。

4 PMC线粒体功能障碍及其诱导的线粒体自噬与中医脾气亏虚密切相关

PD利用腹膜的屏障作用作为半透膜,PD能长期而有效地进行,很大程度上取决于腹膜结构的完整性和功能的有效性,但腹膜过度使用也会导致PMC结构和功能损伤。《素问·热论》中提出“脾主大腹”,明确指出腹膜的结构和功能与脾脏功能强弱有密切关系〔5〕。

4.1中医脾-线粒体密切相关 宏观上,中医学认为,脾具有“主运化”的作用,与肝合为人体枢纽;微观上,线粒体是机体物质代谢和能量转化的中心,是机体进行各项生命活动的枢纽。所以,从人体宏观以及微观的角度,均可认为脾-线粒体共同作为机体“后天之本”“气血生化之源”。

4.2PMC线粒体功能障碍及其诱导的自噬与中医脾气亏虚密切相关 通过对全国8个省市2 546例PD患者进行中医证型分析,发现PD初期脾肾气虚证的比例最大〔27,28〕。脾虚证通常伴随着机体线粒体结构或功能损伤,脾虚证与线粒体氧化损伤相关,并影响能量代谢过程〔29〕。研究表明〔30～32〕,补脾中药和复方可以通过改善脾气虚导致的线粒体功能障碍。首先,四君子汤可明显升高脾虚证大鼠骨骼肌线粒体超氧化物歧化酶(SOD)、Ca-Mg-ATP等酶活性,降低丙二醛(MDA)含量;其次,四君子汤明显升高心衰大鼠心肌组织肌球蛋白轻链2、琥珀酰辅酶A连接酶(Suclg)2蛋白,下调丝氨酸蛋白酶抑制剂A3N、丙酮酸脱氢酶复合体,表明健脾益气中药可减轻线粒体氧化损伤,调节能量代谢,改善骨骼、心脏功能〔30,31〕。林海鸣等〔32〕通过制备水湿困脾动物病理模型,发现培土制水方能清除模型大鼠ROS,减少水湿困脾证大鼠心肌及小肠细胞线粒体的损伤,起到保护细胞的作用。

线粒体自噬活性与脾气是否充足密切相关。通过观察脾气虚大鼠海马神经元线粒体自噬水平及PINK1/Parkin途径的变化,发现脾气虚的发生可能与PINK1/Parkin途径抑制所致的海马神经元线粒体自噬水平下降有关〔33〕。可见,中医脾气亏虚与线粒体功能障碍-自噬存在密切相关性。因此,健脾益气法可能通过调控PINK1/Parkin通路影响PMC线粒体功能及其介导的自噬活性,激活其适应性保护机制,起到保护PMC损伤、防治PF的作用。

综上,线粒体功能障碍可能是从脾论治PF的生物学基础。从脾气虚、线粒体功能相关指标及脾与腹膜组织线粒体的结构变化等方面探讨从脾论治PF的疗效机制,研究具有健脾益气、活血祛瘀和络的健脾益气方能否调控PINK1/Parkin通路影响PMC线粒体功能及其介导的自噬活性,激活其适应性保护机制,可能是保护PMC损伤、防治PF的新靶点。本研究从调养后天之本出发,以期丰富脾-腹膜脏象理论,为PF的防治提供参考和依据。