益气活血清热解毒方对ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化的保护作用

刘志勇 任德启 郭健 赵彦青 杨明辉 李锋森 成家宏

(1河南中医药大学第二临床医学院,河南 郑州 450046;2河南省中医院)

心血管系统疾病是世界范围内死亡率极高的一大类疾病,动脉粥样硬化是多种心血管系统疾病如心肌梗死、脑卒中等的病理基础,动脉粥样硬化受到基因、饮食习惯等的影响〔1,2〕。动脉粥样硬化疾病是一种慢性多因性疾病,多与年老体虚有关,本课题认为,动脉粥样硬化为本虚标实证,虚、痰、瘀、毒为基本致病因素,气阴两虚,痰瘀毒互结为其基本病机,益气活血清热解毒为其基本治法。益气活血清热解毒组中药由制首乌、全蝎、水蛭、天麻、胆南星、蜈蚣、决明子、太子参、桃仁和红花等组成。既往研究显示,中风防治灵(由制首乌、全蝎、大黄、胆南星、决明子、水蛭、天麻、太子参组成)能够改善血脂,扩张脑血管〔3,4〕。现阶段尚未发现关于益气活血清热解毒方对动脉粥样硬化小鼠的作用研究。本研究探讨益气活血清热解毒方对动脉粥样硬化的保护作用及可能机制。

1 材料与方法

1.1材料 SPF级别ApoE-/-小鼠,8周龄,体质量18～19 g,购自河南省中医院实验中心;Janus酪氨酸蛋白激酶(JAK)1抗体购自南京建成生物工程研究所;总胆固醇(TC)检测试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司;磷酸化(p)-信号转导及转录激活因子(STAT)3抗体购自美国Santa Cruz;三酰甘油(TG)检测试剂盒购自上海信帆生物科技有限公司;低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)检测试剂盒购自上海信帆生物科研所;p-JAK1抗体购自美国Abcam;高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)检测试剂盒购自通蔚试剂(上海)有限公司;STAT3抗体购自武汉艾美捷科技有限公司;益气活血清热解毒方、脂泰宁胶囊、黄连由河南中医药大学第二附属医院中药房提供;辛伐他汀片购自杭州默沙东制药有限公司。

1.2动脉粥样硬化小鼠模型构建〔5〕和分组处理 SPF级别ApoE-/-小鼠分成:普通饲料组、模型组、黄连组、脂泰宁组、益气活血清热解毒组、辛伐他汀组,普通饲料组给予正常饲料饲喂,其余几组均给予高脂饲料(0.15%胆固醇、78.85%基础饲料、21.00%脂肪)饲喂,饲喂12 w后,随机选择2只小鼠处死,苏木素-伊红(HE)染色观察易损斑形成,视为造模成功。普通饲料组、模型组、黄连组、脂泰宁组、益气活血清热解毒组、辛伐他汀组小鼠各10只。从第13周开始,黄连组用黄连药液(黄连6 g溶于70 ml蒸馏水)按照9 ml/(kg·d)剂量灌胃,脂泰宁组用脂泰宁药液(脂泰宁胶囊,相当于制首乌20 g,山楂25 g,泽泻15 g,决明子12 g,绞股蓝15 g,溶于70 ml蒸馏水中)按照9 ml/(kg·d)剂量灌胃,辛伐他汀组用辛伐他汀药液(20 mg辛伐他汀溶于70 ml蒸馏水)按照9 ml/(kg·d)剂量灌胃,益气活血清热解毒组小鼠用益气活血清热解毒药液(颗粒剂,太子参15 g,制首乌20 g,水蛭8 g,天麻15 g,胆南星8 g,全蝎8 g,决明子20 g,蜈蚣6 g,桃仁10 g,红花10 g,黄连6 g,溶解在70 ml的蒸馏水中)按照9 ml/(kg·d)剂量灌胃,普通饲料组、模型组以等量的生理盐水代替。连续灌胃8 w。

1.3各组小鼠体质量测定 从第12周开始,每间隔2 w检测小鼠体质量,绘制生长曲线。

1.4血脂指标TC、TG、LDL-C、HDL-C检测 最后一次给药结束后12 h,眼眶静脉丛采血,3 453 r/min离心10 min,分离血清,分别检测TC、TG、LDL-C、HDL-C水平,步骤完全按照TC、TG、LDL-C、HDL-C检测试剂盒的说明书进行。

1.5动脉粥样硬化斑块面积检测 采血结束后,断椎法将小鼠处死,分离小鼠主动脉组织,在光学显微镜下观察主动脉情况,以计算机图像处理软件计算斑块面积和主动脉管腔的面积百分比例。

1.6白细胞介素(IL)-6、IL-1β、细胞间黏附分子(ICAM)-1、血管细胞黏附分子(VCAM)-1 mRNA表达检测 采血结束后,断椎法将小鼠处死,分离小鼠主动脉组织,以实时聚合酶链反应(Realtime PCR)方法检测 IL-6、IL-1β、ICAM-1、VCAM-1 mRNA表达差异。在小鼠主动脉组织中添加Trizol试剂,反复吹打混合,在冰上反应20 min,常规方法提取组织中的总RNA,添加50 μl的焦碳酸二乙酯(DEPC)水将RNA溶解,经过紫外分光光度计检测浓度。反转录合成cDNA,在1.5 μg的RNA中添加1 μl的Random Hexamers、1 μl的dNTPs,最后添加DEPC水至12.5 μl,在65 ℃孵育5 min,置于冰上孵育5 min,继续添加4 μl的5×缓冲液、2 μl的二硫苏糖醇(DTT)、0.5 μl的反转录酶(M-MLV)、1 μl的RNaseOUT,置于37 ℃孵育52 min,70 ℃孵育15 min,将合成的cDNA放在-20 ℃保存。以cDNA作为模板,按照SYBR Realtime PCR master mix进行PCR,条件如下:0.5 μl的cDNA、10 μl的qPCR master mix、1 μl的上游及下游引物,添加ddH2O至20 μl,PCR程序为:95 ℃预变性15 min,95 ℃变性10 s,60 ℃退火20 s,72 ℃延伸30 s,设置40个循环。β-actin作为内参,根据得到的Ct值,按照2-△△Ct方法分析目的基因的表达变化。β-actin上游引物:5′-GGGAAATTCAACGGCACAGT-3',下游:5′-AGATGGTGATGGGCTTCCC-3′,IL-6上游引物:5′-TGAACT-CCTTCTCCACAAGC-3＇,下游:5＇-ATCCAGATTGGAAGCATCCA-3＇,IL-1β上游引物:5＇-CCAAGGAG-ACGGAATACAGG-3′,下游:5′-GTGTTGGTTGTAG-AGGGCAAG-3′,ICAM-1上游引物:5′-TCAGGTATCCATCCATCCCA-3′,下游:5′-CGGTGCCACAGTTCTCAAAG-3′,VCAM-1上游引物:5′-GATAGACAGCCCACTAAACG-3′,下游:5′-TGGAGCCAAACACTTGAC-3′。

1.7p-JAK1、JAK1、p-STAT3、STAT3蛋白表达检测 采血结束后,断椎法将小鼠处死,分离小鼠主动脉组织,Western印迹检测p-JAK1、JAK1、p-STAT3、STAT3蛋白表达。在小鼠主动脉组织中添加RIPA裂解试剂,充分裂解以后,在4 ℃,8 459 r/min离心10 min,吸取上清溶液,按照二喹啉甲酸(BCA)方法检测蛋白浓度。在蛋白样品中添加2×上样缓冲液,混合后,放在100 ℃煮沸5 min。按照常规方法配制十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)(10%分离胶,5%浓缩胶),用移液枪分别在每个上样孔内添加30 μg的蛋白样品,在浓缩胶内以80 V的电压进行电泳,在分离胶中以120 V的电压进行电泳。电泳结束以后,将凝胶取出,浸泡在转移缓冲液中备用。把NC膜置于甲醇中浸泡10 s,然后置于转移缓冲液中备用。根据常规方法进行转膜,转膜操作需要在冰上进行。设置转膜电压为100 V,转膜时间为2 h。将NC膜放在含有5%牛血清白蛋白的TBST中,转移到室温孵育2 h。将NC膜放在含有一抗溶液的平皿内(p-JAK1抗体、p-STAT3抗体按照1∶800稀释,STAT3抗体、JAK1抗体按照1∶1 200稀释),放在4 ℃结合过夜。最后将NC膜放在二抗溶液内(二抗按照1∶4 000稀释),在室温反应2 h。按照ECL显色试剂盒显色。以β-actin作为内参,根据灰度值分析目的蛋白的表达变化。灰度值分析用ImageJ进行。

1.8统计学分析 采用SPSS21.0软件进行t检验、方差分析。

2 结 果

2.1益气活血清热解毒方对动脉粥样硬化小鼠体质量影响 普通饲料组16、18、20 w体质量明显低于模型组,黄连组、脂泰宁组18、20 w体质量明显低于模型组,益气活血清热解毒组、辛伐他汀组16、18、20 w体质量均明显低于模型组,并且黄连组、脂泰宁组18、20 w体质量明显高于益气活血清热解毒组、辛伐他汀组(均P<0.05)。见表1。

表1 各组体质量变化比较

2.2益气活血清热解毒方对动脉粥样硬化小鼠血脂影响 与普通饲料组比较,模型组TC、TG和LDL-C水平明显升高,HDL-C水平明显降低(P<0.05);与模型组比较,黄连组、脂泰宁组、益气活血清热解毒组、辛伐他汀组TC、TG和LDL-C水平明显降低,HDL-C水平明显升高(P<0.05);并且与黄连组、脂泰宁组比较,益气活血清热解毒组TC、TG和LDL-C水平明显降低,HDL-C水平明显升高(P<0.05)。见表2。

表2 各组血脂指标、斑块面积比较

2.3益气活血清热解毒方对动脉粥样硬化小鼠斑块面积影响 与普通饲料组比较,模型组动脉粥样硬化斑块面积明显增加(P<0.05);与模型组比较,黄连组、脂泰宁组、益气活血清热解毒组、辛伐他汀组动脉粥样硬化斑块面积明显减小(P<0.05);与黄连组、脂泰宁组比较,益气活血清热解毒组动脉粥样硬化斑块面积明显减小(P<0.05)。见表2。

2.4益气活血清热解毒方对动脉粥样硬化小鼠炎症介质影响 与普通饲料组比较,模型组IL-6、IL-1β、ICAM-1、VCAM-1 mRNA水平明显增加(P<0.05);与模型组比较,黄连组、脂泰宁组、益气活血清热解毒组、辛伐他汀组IL-6、IL-1β、ICAM-1、VCAM-1 mRNA水平明显降低(P<0.05);与黄连组、脂泰宁组比较,益气活血清热解毒组IL-6、IL-1β、ICAM-1、VCAM-1 mRNA水平明显降低(P<0.05)。见表3。

表3 各组主动脉炎症因子IL-6、IL-1β、ICAM-1、VCAM-1 mRNA、p-JAK1/JAK1、p-STAT3/STAT3蛋白表达水平比较

2.5益气活血清热解毒方对动脉粥样硬化小鼠JAK/STAT3信号通路的影响 与普通饲料组比较,模型组p-JAK1/JAK1、p-STAT3/STAT3蛋白水平明显增加(P<0.05);与模型组比较,黄连组、脂泰宁组、益气活血清热解毒组、辛伐他汀组p-JAK1/JAK1、p-STAT3/STAT3蛋白水平明显降低(P<0.05);与黄连组、脂泰宁组比较,益气活血清热解毒组小鼠p-JAK1/JAK1、p-STAT3/STAT3蛋白水平明显降低(P<0.05)。见表3。

3 讨 论

动脉粥样硬化最初的表现为大、中动脉出现脂质条纹,含有大量的脂蛋白残粒、LDL,血液中大量的LDL沉积在动脉分支,导致内皮细胞被激活,引起炎症反应〔6～8〕。LDL还可以刺激内皮细胞释放更多的趋化因子,诱导ICAM-1、VCAM-1等表达,加强单核细胞的黏附,最终形成动脉粥样硬化斑块〔9,10〕。IL-6、IL-1β是在动脉粥样硬化中表达上调的炎症因子,二者表达增加后诱导机体炎症反应,加重组织损伤〔11～14〕。

益气活血清热解毒方是由太子参、制首乌、水蛭、天麻、胆南星、全蝎、决明子、蜈蚣、桃仁和红花等组成的,临床上已经证明其具有改善脂代谢等作用〔3,4〕。本实验结果表明,益气活血清热解毒方改善动脉粥样硬化血脂、炎症,减少动脉粥样硬化斑块形成,益气活血清热解毒方有动脉粥样硬化保护作用。黄连具有清热解毒的功效,脂泰宁有益气活血的作用〔15,16〕。本实验还比较了益气活血清热解毒方与单纯黄连或脂泰宁的治疗效果,发现益气活血清热解毒方对动脉粥样硬化血脂、炎症和斑块形成的改善作用均优于单纯黄连或脂泰宁的治疗效果。

中药发挥药理学作用的机制十分复杂,很多研究已经证明中药能够通过影响信号通路的转导发挥作用〔17～19〕。JAK是非受体型酪氨酸激酶,在胚胎发育过程中具有重要作用,STAT3是STAT蛋白家族成员,其可以被IL-6等相关细胞因子激活〔20,21〕。JAK/STAT3信号通路传导途径大致可以表述为:细胞因子与受体相互结合后,诱导受体分子发生二聚化,导致和受体耦联的JAK发生磷酸化,磷酸化的JAK能够催化受体酪氨酸发生磷酸化,形成STAT3停靠位点,导致STAT3发生磷酸化,STAT3形成二聚体进入细胞核,进而调控下游基因的表达〔22〕。JAK/STAT3参与调控炎症、细胞生长、氧化应激等多个过程,并且与疾病进展有关〔23〕。研究显示,JAK/STAT3在动脉粥样硬化中过度激活,JAK/STAT3信号加重疾病进程〔24,25〕。本研究结果显示,益气活血清热解毒方明显降低了ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化模型中p-JAK1/JAK1、p-STAT3/STAT3蛋白水平,益气活血清热解毒方抑制JAK/STAT3信号激活,益气活血清热解毒方可能通过JAK/STAT3信号发挥动脉粥样硬化保护作用。

综上,益气活血清热解毒方改善动脉粥样硬化炎症、血脂,减少斑块形成,机制可能与JAK/STAT3信号有关,这为中西医治疗和预防动脉粥样硬化相关疾病奠定了基础。现阶段尚不明确益气活血清热解毒方通过何种机制影响JAK/STAT3信号进而改善动脉粥样硬化,在以后实验中会进行深入探讨。