miR-3195通过调控Wnt/β-catenin信号通路对肺癌细胞生长和转移的影响

何小艳 吴宁 徐培 吕贯廷 李慧 张健 陈丽

(德阳市人民医院病理科,四川 德阳 618000)

据统计结果显示,肺癌已成为全球范围内高发的恶性肿瘤,发病率高达11%〔1〕。肺癌根据组织学类型,又可分为非小细胞肺癌和小细胞肺癌,其中非小细胞肺癌占肺癌总数的80%左右〔2〕。肺癌有高发病率、高病死率的特点,男性患者发病率高于女性,长期抽烟患有肺癌的例数是不抽烟例数的20倍〔3〕。miRNA是早前被发现于真核细胞内的小分子非编码RNA,能与mRNA结合发挥促进或抑制作用影响癌症的发展〔4,5〕。研究发现,非小细胞肺癌患者外周血清内miR-3195表达下调,与总体生存期显著相关,但是对肺癌的具体研究机制尚不清楚〔6〕。Wnt/β-catenin信号通路是常见的信号转导途径,与机体发育、细胞增殖、迁移和侵袭等多种生物学过程有关〔7〕,如miR-199a通过降低Wnt/β-catenin信号通路进而抑制非小细胞肺癌细胞增殖、侵袭和迁移〔8〕。目前关于miR-3195与Wnt/β-catenin信号通路对肺癌细胞生物学特性尚无明确报道,本研究探究miR-3195通过调控Wnt/β-catenin信号通路对肺癌细胞生长和转移的影响。

1 材料与方法

1.1细胞和主要试剂 正常肺上皮细胞BEAS-2B、肺癌细胞A549、H1299、NCI-H446细胞购于中国科学院细胞中心;miR-NC、miR-3195、引物、荧光定量试剂盒购于赛默飞世尔;胎牛血清、DMEM培养基购于美国Gibco公司;转染试剂盒购于美国Intvitrogen公司;通路抑制剂FH535购于北京百奥莱博科技有限公司;CCK8试剂盒购于北京索莱宝生物公司;Trizol试剂盒、逆转录试剂盒购于美国Thermo Fisher公司;细胞周期依赖性蛋白激酶(CDK)4抗体、细胞增殖核抗原(Ki)67抗体、基质金属蛋白酶(MMP)-2抗体、MMP-9抗体、Wnt3a抗体、原癌基因(c-Myc)抗体、β-catenin抗体购于英国Abcam公司;Transwell小室、基质胶购于北京优尼康生物公司;。

1.2细胞培养和分组 从超低温冰箱中取出正常肺上皮细胞BEAS-2B及肺癌细胞H1299、A549、NCI-H446细胞常规条件下对其进行复苏,在含有10%胎牛血清、双抗的DMEM完全培养液孵育,培养箱条件设置为5%CO2、37 ℃。每2 d换1次培养液,细胞培养至第5代时进行后续实验。

取出对数期肺癌细胞NCI-H446并接种至24孔板中,按照转染试剂盒说明书分别将miR-NC、miR-3195转染细胞中,记为miR-NC组、miR-3195组;在转染miR-3195细胞中添加20 μmol/L通路抑制剂FH535,记为miR-3195+FH535组。

1.3实时荧光定量-聚合酶链反应(qRT-PCR)检测miR-3195表达水平 收集正常肺上皮细胞BEAS-2B、肺癌细胞H1299、A549、NCI-H446及各组肺癌细胞NCI-H446,通过Trizol试剂提取各组细胞内的总RNA,按照逆转录试剂盒说明书步骤合成cDNA,配制荧光定量反应体系在PCR仪器进行扩增反应。通过公式2-ΔΔCt计算miR-3195表达水平,U6为内参。

1.4CCK8检测细胞增殖水平 取各组肺癌细胞NCI-H446并制成细胞悬液,然后按照1.0×105个/ml接种96孔板中,置于培养箱中固定培养24、48、72 h,然后每孔加入CCK8试剂,放入培养箱内继续培养4 h,置于酶标仪450 nm波长处检测每孔OD值。

1.5Transwell检测细胞迁移和侵袭 细胞迁移实验:各组肺癌细胞NCI-H446重悬于不含血清的培养液内,处理24 h后并调整细胞密度调(2×105个/ml),取100 μl细胞悬液包被至Transwell小室上室中,下室加入500 μl含有血清的培养液,继续培养48 h,取出小室之后将上室细胞擦去,用4%多聚甲醛固定30 min,结晶紫染色20 min,清洗染液,然后在显微镜下倒置观察细胞迁移数目。细胞侵袭实验:将基质胶稀释后取100 μl铺至Transwell小室的上室内,待其风干后,后续实验步骤与上述迁移实验一致。

1.6Western印迹检测CDK4、Ki67、MMP-2、MMP-9、Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达 取各组肺癌细胞NCI-H446加入裂解液冰上裂解10 min,二喹啉甲酸(BCA)法检测定量蛋白浓度。然后将配制的12%分离胶和5%浓缩胶置于电泳槽中,低电压10～20 V预电泳30 min后点样,将蛋白转移在聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,将PVDF膜以5%脱脂奶粉封闭培养2 h,将入稀释为1∶500的一抗CDK4、Ki67、MMP-2、MMP-9、Wnt3a、c-Myc、β-catenin抗体,4 ℃孵育过夜,加入二抗室温孵育2 h,将电化学发光(ECL)显色剂滴加至PVDF膜上,显影、拍照。用ImageJ分析条带灰度值,以GAPDH作为内参,计算蛋白表达水平。

1.7统计学分析 采用SPSS21.0软件进行单因素方差分析、独立样本t检验。

2 结 果

2.1miR-3195在肺癌细胞中表达水平 与正常肺上皮细胞BEAS-2B(0.99±0.08)相比,肺癌细胞A549(0.57±0.05)、H1299(0.42±0.04)、NCI-H446内miR-3195表示水平(0.36±0.04)显著降低(P<0.05)。因此选取表达水平差异相对较大NCI-H446细胞进行后续实验。

2.2上调miR-3195对肺癌细胞增殖的影响 与miR-NC组相比,miR-3195组中肺癌细胞内miR-3195表达水平显著上升,48、72 h OD值显著降低,CDK4、Ki67蛋白表达显著下降(P<0.05)。见图1、表1。

表1 上调miR-3195对肺癌细胞增殖、侵袭和迁移的影响

图1 Western印迹检测两组CDK4、Ki67、MMP-2、MMP-9蛋白表达

2.3上调miR-3195对肺癌细胞迁移和侵袭的影响 与miR-NC组相比,miR-3195组迁移细胞数、侵袭细胞数显著降低,MMP-2及MMP-9蛋白表达显著下降(P<0.05)。见图1、表1。

2.4miR-3195通过调控Wnt/β-catenin信号通路对肺癌细胞增殖的影响 与miR-3195组相比,miR-3195+FH535组24、48、72 h OD值显著降低,CDK4、Ki67蛋白表达显著下降(P<0.05)。见表2、图2。

表2 miR-3195通过调控Wnt/β-catenin信号通路对肺癌细胞增殖迁移及侵袭的影响

图2 Western印迹检测两组CDK4、Ki67、MMP-2、MMP-9蛋白表达

2.5miR-3195通过调控Wnt/β-catenin信号通路对肺癌细胞迁移和侵袭的影响 与miR-3195组相比,miR-3195+FH535组迁移细胞数、侵袭细胞数显著降低,MMP-2、MMP-9蛋白表达显著下降(P<0.05)。见表2、图2。

2.6上调miR-3195对Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达的影响 与miR-NC组相比,miR-3195组、miR-3195+FH535组Wnt3a、c-Myc、β-catenin蛋白表达显著下降(P<0.05);与miR-3195组相比,miR-3195+FH535组的Wnt3a、c-Myc、β-catenin蛋白表达显著下降(P<0.05)。见表3、图3。

表3 上调miR-3195对Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达的影响

图3 Western印迹检测各组Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达

3 讨 论

研究报道,miRNA与人类疾病发展密切相关,miRNA能参与多种癌症的病理学过程〔9,10〕。研究显示,miRNA在肺癌中失常表达,如miR-124-3p、miR-379-5p、miR-3655、miR-34c-5p等〔11〕。研究结果显示,miRNA-300与非小细胞肺癌的发展有关,在肺癌组织和细胞中表达下调,过表达miRNA-300能抑制非小细胞肺癌细胞增殖、迁移和侵袭,并降低成红细胞特异性转化因子(ETS)1蛋白表达〔12〕。Liu等〔13〕研究结果显示,miR-99b-5p在非小细胞肺癌细胞中表达下调,miR-99b-5p通过抑制卷曲受体(FZD)8表达抑制非小细胞肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭。在肺癌细胞中miRNA-195-5p表达下调,过表达miRNA-195-5p抑制肺癌细胞的增殖、迁移、侵袭〔14〕。miR-3195早前被证实与癌症的发展有关,如miR-3195在喉癌组织中表达降低,过表达miR-3195可以降低喉癌细胞增殖〔15〕。已有报道显示,miR-3195与肺癌发展有关,但是具体的研究报道相对较少,本研究结果说明,miR-3195与肺癌发展密切有关,过表达miR-3195能有效抑制肺癌细胞增殖、迁移和侵袭,这与之前报道结果相似。

Wnt/β-catenin信号通路在肺癌细胞生长、发育、转移中起着重要的作用,该通路异常活化及miRNA异常表达与肺癌发生密切相关〔16〕。Wnt3a是常用的细胞信号通路配体,能够诱导糖原合成酶激酶激酶(GSK)-3β蛋白磷酸化阻碍β-catenin蛋白表达,进而影响下游蛋白c-Myc、细胞周期蛋白(Cyclin)D1等表达〔17〕。有研究结果显示,miRNA-543通过抑制Wnt/β-catenin信号通路影响肺癌发展,以达到抑制肺癌细胞增殖、迁移和侵袭的能力〔18〕。李发祥等〔19〕研究结果显示,miR-509-5p通过抑制高迁移率族蛋白(HMG)A2/Wnt/β-catenin信号通路抑制非小细胞肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭。本研究结果说明,过表达miR-3195对肺癌细胞的发展与Wnt/β-catenin信号通路有关,miR-3195通过调控Wnt/β-catenin信号通路影响肺癌细胞增殖、迁移和侵袭,这与之前的报道结果相似。

综上,miR-3195在肺癌细胞中低表达,过表达miR-3195能抑制肺癌细胞增殖、迁移和侵袭,其作用机制可能与抑制Wnt/β-catenin信号通路有关,下一步本课题组将深入研究miR-3195对肺癌的具体相关机制研究。