基于转录组分析内源激素在调控枇杷花发育进程中的作用

徐红霞,李晓颖,葛 航,朱启轩,2,陈俊伟,*

(1.浙江省农业科学院 园艺研究所,浙江 杭州 310021; 2.河北科技师范学院 园艺科技学院,河北 秦皇岛 066600)

枇杷(EriobotryajaponicaLindl.)是中国南方的重要果树之一,其果实柔软多汁,味道鲜美,营养丰富,且有祛痰止咳、生津润肺等保健功能,深受消费者喜爱。与桃、梨、苹果等蔷薇科果树不同,枇杷在北亚热带地区是秋冬季节开花坐果,从花芽分化到开花是连续进行的,其花芽生理分化始于7月底8月初,花期可以从10月持续到次年2月,花发育过程可长达半年左右。目前虽然已经报道了一些与枇杷花发育相关的基因,包括成花诱导基因EjAP1[1]、EdGI和EdFD[2]、EjFT[3]、EjSOC1[4]、EjAGL17[5]和EjSPL3/4/5/9[6]等,以及成花抑制因子EjTFL1[7]、EjFRI[8]和EjRAV1/2[9]等基因,但对枇杷花整体发育进程的相关机理研究并不多[10],仍缺乏全基因范围内对枇杷花发育过程分子机制的研究报道。

转录组测序是研究基因表达、推测基因功能和阐明关键发育过程的重要手段。越来越多的研究表明,转录组是分析不同花发育时期相关基因的有力工具。Liu等[11]采用转录组技术鉴定和分析了番荔枝的花芽形成和花发育过程,发现差异表达基因中包括大量激素信号传导和昼夜节律基因。Fan等[12]对杜鹃红山茶花芽3个发育时期进行了转录组分析,发现从花芽分化到花器官的形成需要开花时间相关基因的调控,而从花器官形成到花蕾形成受到多种途径的影响,如冷信号和光信号途径、植物激素代谢途径和植物代谢物质的变化。不同的MADS-box基因在花发育过程中发挥着不同的作用。Wang等[13]利用转录组技术分析了番茄花发育过程,率先获得49个与番茄开花时间和花发育相关基因,这些基因大多数属于光周期途径基因,并推测出影响番茄花期早晚的主要原因。

本研究以白肉枇杷品种宁海白为试材,对5个花发育时期进行转录组学分析,以期深入研究枇杷花发育的分子机制,并为花期调节相关的生产措施研发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为8年生枇杷(EriobotryajaponicaLindl.)白肉品种宁海白,2012年种植于浙江省农业科学院杨渡科研创新基地。2020年选取长势基本一致的6棵枇杷树用于试验,分别于7月20日、8月20日、9月10日、9月30日和10月30日采集当年生春梢上处于花芽生理分化期(EjS1)、花芽形态分化期(EjS2)、花穗发育期(EjS3)、小花发育期(EjS4)和开花期(EjS5)的顶芽、花芽或花穗,经液氮冷冻后于-80 ℃保存,用于转录组和生理指标测定。每组样本3个生物学重复。

1.2 石蜡切片

挑选当天取得的健康饱满的顶芽、花芽或花穗中的花蕾,用FAA固定液固定,并参照常规石蜡切片方法制片,切片厚8 μm;然后使用番红-固绿对染,中性树胶封藏,最后在OLYMPUS BX60显微镜下观察拍照[14]。

1.3 激素含量测定

生长素(IAA)、脱落酸(ABA)、玉米素核苷(ZR)、赤霉素(GAs)含量测定采用酶联免疫吸附分析法(enzyme-linked immunosorbent assays,简称ELISA)[15-16]。IAA、GAs、ABA、ZR标准品均购自Sigma公司,每组样品重复测定3次。

1.4 总RNA提取与转录组测序

采用TIANGEN公司的多糖多酚RNA提取试剂盒提取样本的总RNA(TIANGEN,北京);采用Thermo公司的Nanodrop仪器检测RNA的浓度和纯度;并用琼脂糖凝胶电泳分析RNA质量。RNA检测合格后委托北京诺禾致源生物科技有限公司进行测序文库构建和转录组测序分析。

1.5 基因功能注释与表达丰度分析

拼接获得基因后,与NR(non-redundantprotein sequence database,非冗余蛋白数据库)、NT(nucleotide sequence database,核酸序列数据库)、Pfam(http://pfam.xfam.org/)、KOG(clusters of orthologous groups for eukaryotic complete genomes,真核生物蛋白质直系同源簇)、Swiss-prot(swiss-prot protein sequence database,Swiss-Prot蛋白质序列数据库)、KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,京都基因与基因组百科全书)和GO(gene ontology)共7个公共数据库进行比对并得到unigene的功能注释信息。根据unigene与Nr、Pfam数据库的注释结果得到GO功能注释信息,利用KASS r140224软件得到KEGG通路注释信息。使用RPKM(reads per kilobase of exon model per million mapped reads)统计已知基因的表达情况,RPKM越大,表达水平越高[17]。

1.6 差异表达基因(DEGs)的对比分析

通过FDR(false discovery rate)设定阈值的方法来筛选DEGs[18],两组对比中,将|log2 fold change|≥2且FDR<0.05的基因标注为DEGs。

1.7 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)验证

根据转录组数据分析结果,随机挑选12个枇杷花发育相关基因进行qRT-PCR验证。提取各样品总RNA并按全式金普通反转录试剂盒(AH311-02)操作说明合成cDNA。参照转录组测序得到的相关基因序列信息,采用Premier 5.0 软件设计引物(表1)。使用SYRB Premix ExTaqⅡ(TaKaRa:Code No.RR820A)实时定量PCR试剂盒,在Light Cycler 480 Ⅱ(Roche)实时定量PCR 仪进行定量分析。20 μL反应体系:SYRB Premix ExTaqⅡ10 μL,cDNA模板2 μL,上、下游引物各0.8 μL(10 μmol·L-1),ddH2O 6.4 μL。扩增反应程序:95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,共40个循环。然后95 ℃ 5 s,60 ℃ 1 min,95 ℃ 15 s作为熔解曲线分析程序。以枇杷Ejactin作为内参基因,相对表达量计算采用2-ΔCT法[19]。

表1 荧光定量PCR中所用差异表达基因及其引物序列

1.8 数据统计

采用IBM SPSS Statistics 20软件进行数据分析,运用单因素方差分析(ANOVA)和Duncan’s多重极差法进行各处理的平均值检验,用最小显著性差异法(LSD)进行差异显著性分析(P≤ 0.05),采用Excel软件统计数据并制图。

2 结果与分析

2.1 不同发育时期枇杷花的表型

枇杷春梢或夏梢成熟老化以后进入生理分化期(EjS1),此时花芽和叶芽形态上没有明显差别,花芽原基未出现;接着顶芽开始膨大,石蜡切片中能看到花原基出现,花芽进入形态分化期(EjS2);随后花芽进一步发育成花穗(EjS3),出现花瓣、雄蕊、雌蕊等花器官原基;花穗上花蕾出现(EjS4),花器官发育完成;最后花器官发育成熟,进入开花期(EjS5)。

2.2 不同发育时期花中内源激素含量变化

IAA、ABA、GA和ZR含量在花发育过程中的变化如图2所示。IAA含量在花发育不同时期变化相对剧烈,在EjS3时期含量最高,分别为EjS1、EjS2、EjS4和EjS5时期的1.56倍、2.43倍、1.68倍和2.41倍。ABA含量在EjS1至EjS3时期保持在较高水平,然后急剧下降,并在EjS5时期降至最低。GA含量在整个发育过程中呈现先下降后升高再下降的趋势,其中EjS2时期GA含量最低,EjS4时期含量最高,最高值是最低值的2.61倍。ZR含量在整个发育过程中相对稳定,只在EjS3时期出现一个峰值。

EjS1,花芽生理分化期;EjS2,花芽形态分化期;EjS3,花穗发育期;EjS4,小花发育期;EjS5,开花期。下同。标尺为200 μm。

柱上无相同字母表示差异显著(P<0.05)。

2.3 转录组测序、组装与注释

对枇杷花5个发育时期的15个样品进行转录组测序,共获得854 450 006条原始数据(raw reads),将有接头的、质量低的原始系列进行过滤,共获得123.1 Gb clean data,各样品均达到8.20 Gb,Q30碱基百分比在92.18%及以上。通过对这些转录本进行组装和聚类分析,共获得322 827个unigenes,平均长度527 bp。将获得的unigenes在7个公共数据库进行注释,结果显示,在KEGG数据库中被注释到的unigenes最少,仅52 186个,在GO数据库中被注释到的unigenes最多,达120 666。在所有数据库中都注释到的unigenes只占unigenes总数的6.00%,有59.82%的unigenes至少在一个数据库注释到(表2)。

表2 Unigene在7个公共数据库的注释情况统计

2.4 DEGs分析

图3-A展示了所有基因在5个发育时期中的表达和聚类情况,从图中可以看出不同发育时期基因表达有明显差异。以EjS1时期转录组数据作为对照来筛选差异基因,比较组别EjS2 vs EjS1、EjS3 vs EjS1、EjS4 vs EjS1和EjS5 vs EjS1分别鉴定得到844、9 581、11 028和15 798个DEGs(图3-B)。从绘制的韦恩图得出,只在EjS2 vs EjS1中差异表达的基因有351个,只在EjS3 vsEjS1中差异表达的基因有3 148个,只在EjS4 vs EjS1中差异表达的基因有2 091个,只在EjS5 vs EjS1中差异表达的基因有6 565个,在各比较组中都差异表达的基因有290个(图3-C)。以上结果说明,越到发育后期参与的基因越多,涉及的表达调控途径可能会越复杂。

图4的差异基因KEGG代谢富集通路结果显示,在EjS2 vs EjS1、EjS3 vs EjS1、EjS4 vs EjS1和EjS5 vs EjS1的4个比较对中,植物激素信号转导(plant hormone signal transduction,KO04075)、植物病原体相互作用(plant-pathogen interaction,KO04626)、光合作用天线蛋白(photosynthesis-antenna proteins,KO00196)、苯丙素生物合成(phenylpropanoid biosynthesis,KO00940)、二萜生物合成(diterpenoid biosynthesis,KO00904)和α-亚麻酸代谢(alpha-linolenic acid metabolism,KO00592)这6个代谢途径都得到显著富集,说明这些途径在枇杷花发育的整个过程中起着重要作用。其中,植物激素信号转导(KO04075)途径在4个比较对中富集的差异基因数量多于其他5个代谢途径。

图4 枇杷花发育进程中差异表达基因KEGG代谢通路富集分析

2.5 与激素信号转导和代谢相关基因分析

为研究植物激素与枇杷花发育之间的关系,我们对花发育过程中与激素信号转导和代谢相关的基因进行了分析,结果见图5。DEGs中有50个花发育相关基因被注释到生长素代谢和信号转导相关通路。色氨酸氨基转移酶基因(TAA1)和吲哚-3-丙酮酸单加氧酶基因(YUCCA)作为编码依赖色氨酸合成IAA的吲哚乙酰胺途径中关键酶合成基因在花芽分化中发挥重要的作用。DEGs筛选结果显示:2个TAA1基因(c120828_g2、c129292_g1)在花芽形态分化期(EjS2时期)下调表达;5个YUCCA基因(c125265_g1、c95091_g1、c95091_g2、c125265_g3、c132408_g2)在EjS2时期下调表达,其中c95091_g1在EjS2时期的表达丰度比EjS1时期下调了67.2%。这些结果与EjS2时期低IAA含量相一致。

另外,筛选鉴定到参与生长素信号转导途径的DEGs包括17个生长素吲哚乙酸蛋白质基因(auxin-responsive protein IAA,AUX/IAA)和5个生长素调控因子(auxin response factors,ARF),其中14个AUX/IAA在EjS2时期下调表达,3个ARF在EjS2时期上调表达。IAA10(c121103_g2)、IAA12(c121103 _g1)、IAA14(c124708_g2)、AUX28(c130659_g1)和ARF(c133615_g2、c133615 _g3)在EjS1时期表达丰度最高,这表明它们在早期花序分生组织形成中可能起作用。然而,4个AUX基因(c122091_g1、c129259_g3、c1292559_g5、c119396_g1)和IAA基因(c107802_g1、c129259-g4、c126304_g1)的表达在花发育过程中持续增加,在EjS5时期达到最高,这与IAA含量的变化不一致,这表明AUX/IAA可能受其他代谢途径影响。

在通过类胡萝卜素途径合成ABA的过程中,鉴定到2个编码ABA合成关键酶——9-环氧类胡萝卜素加氧酶(9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase,NCED)基因(c130608_g1、c102674_g1),其在EjS2和EjS3时期表达丰度持续显著下降,在EjS4时期表达丰度增加,在EjS5时期表达丰度又略有下降。同时,鉴定到的7个编码ABA降解关键酶脱落酸8’-羟化酶基因CYP707A中有3个基因(c129324_g6、c128252_g4、c127739_g4)从EjS3到EjS5时期表达丰度持续升高。ABA含量同时受合成和分解途径所调控,总体来看,在整个花发育过程中,ABA合成能力在花发育后期明显比前期弱。另外,在ABA信号传导相关DGEs中鉴定到1个蔗糖非发酵相关蛋白激酶——蛋白磷酸酶2C(protein phosphatase 2C,PP2C)基因(c132890_g1),其负调控脱落酸信号传导途径,在EjS2时期表达丰度达到最高,比EjS1时期上调53.9%,随后在EjS3时期迅速下降到最低,表达丰度仅为EjS2时期的13.2%;而脱落酸受体PYR/PYL(pyracbactin resistance/pyracbactin resistance-like)家族蛋白基因PYL(c122656_g3、c133276_g2)、PYR(c73758_g3)和丝氨酸/苏氨酸残基蛋白磷酸酶激酶(SNF1-related kinases,SnRK2)基因(c124692_g1、c118602_g1)在EjS5时期表达丰度最高。

GA和细胞分裂素生物合成和信号转导途径相关基因在5个花发育时期中也有明显差异表达。在GA合成过程中,鉴定到12个GA合成关键酶基因,其中GA20氧化酶(gibberellin 20 oxidase,GA20ox)基因(c125517_g1、c110389_g1)在花芽分化期下调表达;编码GA3-β氧化酶(gibberellin 3-beta-dioxygenase,GA3ox)基因随着花发育进程表达量持续上升,在EjS2、EjS3、EjS4和EjS5时期表达丰度分别为EjS1时期的1.49、1.54、2.15和2.96倍;而鉴定到的7个使GA活性失活的GA2-加氧酶(GA2ox)基因中,有4个(c123253_g1、c128263_g1、c130655_g3、c120654_g1)在EjS2时期上调表达,有3个(c123980_g1、c129658_g1、c122680_g1)在EjS2时期下调表达。

GA的受体蛋白(GID)基因(c124653_g1、c125843_g1)在EjS2时期表达量比EjS1时期上升22.9%和76.9%。细胞分裂素合成限速酶异戊烯转移酶(IPT)基因(c122671_g1、c126694_g7)在EjS2时期表达丰度比EjS1时期明显升高,分别为EjS1时期的1.19倍和4.89倍,而催化细胞分裂素降解的细胞分裂素氧化酶(CKX)基因(c76633_g1、c121318_g1、c199640_g1)在EjS3时期表达丰度低于其他4个时期。在细胞分裂素信号转导途径中部分响应调节因子(Arabidopsisresponse regulars,ARR)基因ARR1(c131283_g1)和ARR11(c130298_g1)在EjS4时期表达丰度最高,ARR6(c127193_g1)、ARR8(c131619_g1)和ARR9(c125948_g2)在EjS1时期表达丰度最高。

2.6 与花发育进程相关的MADS基因家族分析

从转录组数据中共筛选获得55个MADS差(c140946_g1)的表达丰度在EjS3中达到高峰,表明它们主要与调控花穗发育相关。SEP(c126115_g3)、MADS6(c125934_g3)和AGL18(c132511_g2)等基因在花发育后期(EjS4和EjS5时期)表达丰度显著增加,FLC(c132593_g1)、MADS21(c104514_g1)、AGL6(c13224_g1)、SVP(188540_g1)和AGL62(c173647_g1)等基因在EjS5时期特异表达,这表明它们在花发育和开花过程中发挥重要作用。

异表达基因。这些MADS基因可以根据其表达模式分为若干类(图6),开花抑制基因SVP(132152_g1)和FLC(c128866_g4)在EjS1时期表达丰度最高,随后开始下降。SVP(132152_g1)在EjS2、EjS3、EjS4和EjS5时期表达丰度分别为EjS1的63.9%、54.1%、41.9%和28.9%。FLC(c128866_g4)的表达丰度在EjS2时期维持较高水平,在EjS3时期迅速下降,EjS5时期表达丰度仅为EjS1时期的5.3%。CAL(c128672_g1、c128866_g3)、AGL24(c134558_g5、c118626_g2)、AGL61(c135255_g3)和SOC1(c190298_g1、c123324_g1、c134904_g2、c28892_g1)在EjS2时期的表达丰度明显高于其他4个时期,表明这些基因在调控花芽形成中起重要作用。SGT1(c126903_g1)、SVP(c134558_g3)、AGL18(c134558_g1)和AGL24

图6 枇杷花发育进程中MADS基因家族成员基因表达热图

2.7 qRT-PCR验证

为验证RNA-seq结果的可靠性,选择12个花发育相关DEGs进行qRT-PCR试验,包括2个SOC1基因(c131331_g2,c123324_g2)、1个LEAFY基因(c125200_g1)、1个FT基因(c132831_g2)、1个AGL24基因(c118626_g2)、1个AP1基因(c125934_g2),1个AP2基因(c129345_g1)、1个SEP基因(c126115_g3)、1个TFL基因(c113629_g1)、1个CAL基因(c128672_g1)、1个FLC基因(c128866_g4)、1个SVP基因(c132152_g5)。结果表明,qRT-PCR和RNA-seq得到的基因表达趋势基本一致(图7),说明转录组测序结果比较准确。不同的开花基因表达丰度在花发育不同时期有差异,说明它们分别调控不同花发育时期。

图7 十二个花发育相关基因在不同发育时期的表达丰度

3 讨论

植物花发育进程相关机制极其复杂,转录组是一项灵敏而全面的技术,可用于系统研究花发育过程相关代谢通路。本研究对枇杷花5个不同发育时期的转录组数据进行分析,KEGG富集分析结果显示,DEGs显著富集在植物激素代谢和信号转导途径上。植物激素代谢和信号转导是一个庞杂的调控网络,不同种类激素能单独或相互协调发挥作用,影响植物细胞分裂、伸长、组织器官分化,进而调控植物萌发、生长、开花、结实、衰老等过程[20]。大量研究表明,植物内源激素水平与成花转变和花发育密切相关[21-22],但其在木本果树花发育过程中的调控机制并不十分清楚。

生长素在植物花原基的形成、花器官分化和整个花发育中起着关键作用[23]。IAA含量在EjS2时期达到最低值,说明IAA含量低有利于枇杷花芽的形成。牛辉陵等[24]研究表明,枣花花芽分化初期需要低水平IAA,在花期则需要较高水平IAA。王玉华等[25]也发现,大樱桃生理分化期的花芽中IAA含量较低,远低于叶芽中IAA含量,说明IAA抑制大樱桃的花芽分化。在荔枝和番荔枝的花芽诱导过程中,大量生长素运输和信号转导相关的基因表达水平发生了变化[11,26]。枇杷花发育过程中,许多生长素相关基因如ARF和Aux/IAA的表达水平也发生了显著变化,表明ARF-Aux/IAA调节途径对枇杷花的发育至关重要。本研究中,ARF(c133615_g2、c133615 _g3)主要在EjS1时期表达,ARF(c 274492_g1)在EjS4时期高表达,ARF(c126278_g1)的表达在EjS5时期达到高峰,表明它们在枇杷花发育不同时期具有不同功能。

关于ABA在果树开花中的作用,目前研究结果尚不一致。有研究表明,ABA能使植物生长减缓,加强淀粉和糖等营养物质的积累,为成花转变做准备;ABA还可以诱导植物进入休眠状态,使生长点不能向生殖生长转变,从而抑制开花[27]。Shan等[28]认为,ABA能促进一些木本植物的花芽分化。在苹果梨中低水平的ABA有利于花芽生理分化,而高水平的ABA则有助于花芽形态分化[29]。在枇杷花发育过程中,花芽中ABA含量保持较高水平,在EjS3时期达到最高值,然后急剧下降,在EjS5时期降到最低,表明在枇杷中高ABA含量有利于花的形成。有趣的是,许多ABA信号通路成员在EjS1至EjS3时期表达下调,如NCED5(c102674_g1)、NCED1(c130608_g1)、CYP707A2(c104212_g1)和CYP707A1(c129708_g5)。这可能是因为ABA合成受多个基因共同调控,在花的发育过程中,可能存在复杂的调控系统来控制每一时期的变化,并确保花朵发育良好。

GA与植物成花调控紧密相关[30]。在苹果[31]、杧果[32]和荔枝[33]等果树中的研究表明,GA对木本果树的花芽分化和开花过程起抑制作用。GA对植物花芽分化的影响是复杂的,不同种类GA对同种植物的成花具有不同的效应,如GA3会抑制苹果开花,而GA4则会促进苹果开花[34]。GA在花发育不同时期有不同效果,如Yamaguchi等[35]研究发现,GA能在生理分化期促进拟南芥成花转变,但在形态分化期抑制花的形成。在本研究中,GA含量在EjS2时期达到最低值,分化后逐渐增加,在EjS4时期达到最高值,开花期显著降低。说明低含量GA促进枇杷花芽分化,高含量GA促进枇杷开花。

在多种植物中已发现GA2OX家族基因催化GA生物合成途径的后续步骤[36]。本研究中发现2个GA合成基因GA2OX2(c123980_g1)和GA2OX8(c130655_g3)在开花过程中表达水平显著降低,这与开花过程中GA含量的降低是一致的。然而,另外2个GA合成基因GA3OX(c13758_g1)和GA20OX2(c110389_g2)的表达在枇杷开花过程中上调。在拟南芥中,GA3OX1在GA的合成和环境刺激反应中同时发挥作用[37-38]。这可能是由于GA种类较多,且生物学功能不同造成的,这也表明在花芽形成和花发育过程中GA生物合成的调节机制是多样的。

细胞分裂素在植物生长发育过程中扮演重要的角色,包括花芽原基萌发和花芽诱导过程[39]。罗羽洧等[40]发现,在无花果花芽分化过程中,ZRs含量逐渐升高,随后稳定在较高水平。曹尚银等[41]研究发现,ZRs能够促进苹果的花芽分化,细胞分裂素含量在花芽的生理分化期处于较高水平,而在叶芽中含量则极低。Nishimura[42]等发现,植物中细胞分裂素受体基因缺失可能使植物持续保持营养生长直到死亡。

本文中对于细胞分裂素合成和信号途径相关基因的表达水平进行了分析,细胞分裂素合成限速酶基因IPT(c122671_g1)在EjS2时期表达丰度明显高于EjS1时期,而催化细胞分裂素降解的CKX基因(c76633_g1、c121318_g1、c199640_g1)在EjS3时期表达丰度低于其他4个时期,这与ZR含量的变化相一致。本研究中ZR含量变化在花芽分化早期稳定,在EjS3时期显著增加,在花器官形成后显著降低,并在开花期间保持稳定,推测高含量ZR能促进果树花芽分化和花穗形成,并可能与花器官分化有关。

大量研究表明,MADS-box基因家族在植物花器官的启动、分化与建成过程中起关键调控作用[43],双子叶植物花发育过程一般是细胞先从茎尖分生组织转变为花序分生组织,随后花序分生组织周边产生花分生组织,然后分化成各轮器官。不同水平MADS-box基因共同调控表达,会导致花发育进入不同形态结构。在开花启动过程中,MADS-box基因的作用分2类,一类是开花强抑制因子(FLC、SVP);另一类是调控花芽分化的开花整合因子(FT、SOC1等)和花原基特征基因(AGL24、AP1、CAL、FUL、LFY等)。FLC可以直接抑制开花整合因子FT和SOC1的转录表达进而抑制开花[44-45],而SVP可以与FLC相互作用负调控开花整合因子的转录活性[46]。本研究结果显示,开花抑制基因SVP(132152_g1)和FLC(c128866_g4)在花芽形成前本底转录水平最高,花芽分化启动后,其表达受到抑制。FT和SOC1是2个关键的开花整合因子,其中SOC1为MADS-box家族基因,茎尖分生组织内SOC1和其他因子上调引发营养生长向花序分生组织特性的转变[47]。AGL24、AP1、CAL、FUL和LFY等花原基特征基因对花分生组织的产生有决定性的作用[48-49]。本研究中,CAL(c128672_g1、c128866_g3)、AGL24(c134558_g5、c118626_g2)、AGL61(c135255_g3)和SOC1(c190298_g1、c123324_g1、c134904_g2、c28892_g1)在EjS2时期的转录水平达到最高,说明它们的高表达决定了枇杷花芽的分化。MADS-box基因在调控花器官建成过程中也具有重要作用,花分生组织细胞增殖和扩大,经花器官特征基因(如AP1、AG、SEP等)的调控在原基侧翼按时间顺序依次从外向内形成不同花器官[50]。本研究中AGL18(c134558_g1)和AGL24(c140946_g1)的表达丰度在花器官原基出现时(EjS3时期)达到高峰;AP1(c125934_g2)在EjS3和EjS4时期转录水平高于其他3个时期;SEP(c126115_g3)、MADS6(c125934_g3)和AGL18(c132511_g2)等基因在花发育后期高表达,而MADS21(c104514_g1)、AGL6(c13224_g1)和AGL62(c173647_g1)等基因在开花期特异表达。因此,MADS-box转录因子通过协调各类分生组织中特征基因的表达来控制花发育的进程与开关。

植物激素可以和MADS-box转录因子共同作用调控植物开花进程。例如,作为典型的生长素响应家族基因,一些ARF基因参与营养生长向生殖生长的转变,以及花的发育过程。在拟南芥中,ARF3整合了AGAMOUS和APETALA2在花分生组织形成中的功能[51],而ARF6和ARF8在控制营养器官和花器官的生长和发育方面具有保守功能[52]。同时,在拟南芥中还发现ABA能促进FLC的表达或与DELLA蛋白相互作用抑制成花转变[53]。Porri等[54]研究表明,GA通过与SOC1基因相互作用来调节植物花芽分化和花发育,而SOC1可以直接与SPLs基因结合来调节SPLs的表达。也有研究认为,GA可以通过下调FT基因表达抑制植物进行花芽分化[32]。另外,Bonhomme等[55]发现,细胞分裂素可以通过激活白芥中MADS-box家族基因来促进营养生长向生殖生长转变。外源细胞分裂素可以通过促进FT同源基因的表达来诱导植物开花[39]。但是,植物激素和MADS-box家族基因之间如何共同调控枇杷花发育过程,仍需进一步深入研究。

总之,激素代谢和信号传导途径是影响枇杷花发育进程的重要途径之一,不同激素在不同发育时期功能不同,而激素代谢和信号传导相关基因协同作用调控不同激素水平,并与MADS-box家族基因共同作用,调控枇杷花发育进程。