猪纤维蛋白原中枸橼酸离子含量测定药典方法的改进
2023-08-22唐明花刘璐
唐明花 刘璐
（1.上海利康瑞生物工程有限公司 上海 201707；2.上海昊海生物科技股份有限公司 上海 201613）
临床手术中，难以缝合或缝合后渗血等问题给手术的进行或者术后患者的恢复造成不小的困扰，选择合适的医用粘合剂是简便有效的解决办法。纤维蛋白粘合剂是一种天然粘合剂，因其具有良好的生物相容性，安全且不产生溶血等，在骨科、肝外科、脑/神经外科、乳腺外科和胰腺手术等临床中均有广泛应用。纤维蛋白粘合剂通过与自身机体的凝血系统的相互作用而产生预期凝血效果，同时亦能粘附在创面，发挥物理止血。枸橼酸钠作为猪纤维蛋白原中一种重要辅料，根据相关要求须控制其中的辅料量，所以找到适合本产品中枸橼酸离子含量测定的方法尤为重要[1-3]。
枸橼酸离子测定法收录在中国药典2020 版四部通则3108 中，其包含第一法比色法，第二法高效液相色谱法（一），第三法高效液相色谱法（二）[4]。
本产品枸橼酸离子含量测定选用的是第一法比色法。按照此方法进行检样的过程中，发现数据重现性差，药典给出的线性浓度范围不适合本产品，蛋白沉淀方式不合理等一系列问题，且试验现象，如反应后体系颜色等存在不确定性。所以本研究对供试品的处理方式，乙酸酐与吡啶体积比等进行了一系列的改进，并经过方法学验证[5-7]。
1 材料与方法
1.1 样品与试剂
猪纤维蛋白原（公司自制，批号：S20181201、S20181215、S20190322）；枸橼酸钠对照品（中国食品药品检定研究院）；其他试剂均为市售分析纯。
1.2 溶液配制
1）对照品溶液 精密称量经减压干燥至恒重的枸橼酸钠0.53 g，置100 mL 量瓶中，加纯化水溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取5 mL，置50 mL 量瓶中，用5%三氯乙酸溶液稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液。
2）供试品溶液 取1 瓶猪纤维蛋白原，精密加入纯化水2.5 mL，放置37 ℃水浴中至猪纤维蛋白原溶解，3瓶混匀；精密量取上述溶液1 mL 与纯化水2 mL，混匀，以8 000 r/min 离心处理10 min；精密量取上清液0.5 mL与纯化水4.5 mL，加入10%三氯乙酸溶液5 mL，混匀置60 ℃水浴中加热5 min，以8 000 r/min 离心10 min，取上清液备用，即为供试品溶液。
3）专属性溶液 5%三氯乙酸溶液，取5 g 三氯乙酸，加纯化水100 mL 进行溶解，混匀即得。
4）准确度溶液 取精密称定经减压干燥至恒重的枸橼酸钠0.40 g，置25 mL 容量瓶中，加纯化水溶解后定容至刻度，混匀待用，记为准确度溶液1。精密量取0.4、1.0、1.2 mL 准确度溶液1 置不同具塞试管中，再各精密加入主体胶溶液1 mL，分别加入纯化水4.6、4.0、3.8 mL，混匀后8 000 r/min 离心10 min；精密量取各上清液0.5 mL 与纯化水4.5 mL，加10%三氯乙酸溶液5 mL，混匀，置60 ℃水浴加热5 min，以8 000 r/min离心10 min，取二次上清液备用，每组准确度测定溶液平行配制3 份（溶液1、溶液2、溶液3）。
1.3 测定方法
精密吸取对照品溶液，配制成0.372、0.558、0.744、0.930、1.116 mmol/L 的线性溶液，吸取上述线性溶液各1 mL 置不同具塞试管中，各精密加吡啶1.3 mL，混匀，再精密加入醋酸酐5.1 mL，立即混匀并置（31±1）℃的水浴中，准确放置35 min 后，按紫外-可见分光光度计法，在波长425 nm 处测定吸光度。以线性溶液的枸橼酸离子浓度（mmol/L）对其相应的吸光度值作直线回归，求得直线回归方程。
2 结果
2.1 冰浴效果考察
本方法对反应温度有严格要求，反应液于室温放置会导致澄清度降低、黄色加深，从而影响吸光度测定的准确性。在试验过程中发现，将反应液置于冰浴可较好地避免这些问题的发生（图1）。
图1 不同温度对反应液颜色变化的影响
2.2 乙酸酐和吡啶体积比对枸橼酸离子含量测定的影响
配制一定浓度的枸橼酸钠溶液（溶液1、2），按照中国药典方法中乙酸酐与吡啶体积为5.7∶1.3 mL 时，测得的含量结果与配制浓度的比值结果不理想。当体积比（mL）为5.1∶1.3、5.7∶1.5 时，检测所得含量值与配制浓度的比值近似于100%，结果较好（表1）。考虑为减少易制毒试剂乙酸酐的使用量，故改进后方法选用乙酸酐和吡啶体积分别为5.1 mL 和1.3 mL。
表1 乙酸酐和吡啶体积比对枸橼酸离子含量测定的影响
2.3 专属性
取专属性溶液上样测定，测得吸光度值分别为0.000 0、0.000 1，结果显示该溶液对枸橼酸离子含量测定不产生干扰。
2.4 线性
将配制的线性溶液上样测定，获直线回归方程为y=0.394 7x+0.055 5，相关系数r为0.997 9，该方法可测定含量范围为22.32～66.96 mmol/L。
2.5 准确度
取准确度溶液1 mL 上样测定，计算求得回收率。结果显示3 组不同浓度的平均回收率（n=3）分别为100.6%、101.0%、98.79%，9 组准确度溶液的回收率测得结果的平均值为100.1%（n=9），RSD 为1.48%（n=9）（表2），表明用所建立方法测得的含量值与加入量相比，基本接近，方法准确度较好。
表2 回收率试验
2.6 精密度（重复性/中间精密度）
在不同的日期，由两位实验员分别平行制备6 份供试品溶液，测定吸光度，并计算枸橼酸离子含量。结果显示两位实验员测得12 份样品中枸橼酸离子含量的平均值为29.94 mmol/L，RSD 为1.57%（n=12），结果满足自定接受标准（RSD ≤5.0%）（表3）。
表3 精密度（重复性/中间精密度）
2.7 溶液稳定性
对照品溶液于2～8 ℃放置72 h、样品溶液于室温放置1 h 时所测得的枸橼酸离子含量与0 时间点测得的含量的比值均在95.0%～105.0%之间，表明样品和对照品稳定性良好（表4）。
表4 溶液稳定性
2.8 耐用性
对蛋白沉淀温度、反应水浴温度及最大吸收波长稍作改变，考察本方法的耐用性，结果显示各参数改变后测得的枸橼酸离子含量与中国药典规定条件下测得的比值均在95.0%～105.0%，满足自定标准（95.0%～105.0%），说明该方法耐用性良好（表5）。
表5 耐用性结果
2.9 样品检测
取3 批猪纤维蛋白原进行检测，其枸橼酸离子含量分别为29.61、29.58 和30.30 mmol/L，均符合纤维蛋白原枸橼酸离子含量的质量标准（不大于60 mmol/L），说明该方法的稳定性好，检测数值偏差较小。
3 讨论
中国药典中对反应结束后的溶液放置条件没有明确，造成实际应用中会出现待测溶液褪色现象，其吸光度值出现较大变化等问题，且该变化存在不确定性，造成测定结果的重现性差。通过研究，明确放置条件，大大提高了样品的吸光度值的稳定性。
该方法的检测数据专属性强，线性和范围、准确度和精密度结果良好，在后续产品检测中重现性良好，可以作为猪纤维蛋白原中枸橼酸离子含量的测定方法。本方法亦顺利通过中国食品药品检定研究院的方法复核。
因本方法的反应试剂用到了易制毒试剂乙酸酐，购买流程比较繁琐；且本方法的时间性很强，需要严格控制反应试剂的加入量，对检验人员操作熟练度要求也较高。所以下一步的研究将寻找一种更为简便的方法。
