基于网络药理学探究布地奈德治疗IgA 肾病的作用机制

张康，赵婷婷，张波，高梦琦，李昱熹，王邵鹏，赵文景*

IgA 肾病（immunoglobulin A nephropathy，IgAN）是世界范围常见的原发性肾小球肾炎［1］，占我国原发性肾小球肾炎的52.66%［2］，25%～30%的IgAN 患者在确诊后20 年内会进展至终末期肾病［3］，成为家庭和国民经济的沉重负担。目前尚无针对IgAN 有效且安全的治疗方案。2021 年改善全球肾脏病预后组织（KDIGO）指南推荐IgAN 的治疗重点是优化支持治疗，包括血压管理、使用最大耐受剂量的肾素-血管紧张素系统抑制剂（renin-angiotensin system inhibitors，RASI）、 生活方式改变等；对于经过了至少90 d 的优化支持治疗，仍有疾病进展风险的IgAN 患者可以考虑为期6 个月的皮质类固醇治疗［4］。然而，糖皮质激素的长期疗效和安全性仍存在争议，STOP-IgAN 研究显示在高危IgAN患者中加强免疫抑制治疗并不能延缓估算肾小球滤过率（eGFR）下降，且不良反应明显增加［5］；TESTING研究显示足量激素治疗IgAN 可显著减少蛋白尿，减少63%的肾衰竭事件，但严重不良事件风险增加4.63 倍［6］。

近年来针对IgAN 治疗的新药研究进展迅速，其中靶向迟释布地奈德胶囊是全球首个IgAN 对因治疗药物。2022 年10 月，布地奈德肠溶胶囊的Ⅲ期临床试验NeflgArd 公布了其研究结果，表明布地奈德肠溶胶囊在降低蛋白尿方面具有显著优势，且肾功能稳定，无严重不良反应发生，但其治疗IgAN 的作用机制尚未完全明确［7］。本研究通过网络药理学的方法探索布地奈德治疗IgAN 的作用靶点，进行药物-疾病靶点相互作用分析、基因本体（gene ontology，GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析，为布地奈德治疗IgAN 的临床实践提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 布地奈德基本信息的获取 通过Chemical Book（https://www.Chemical Book.com/）获取布地奈德的分子式和结构式。

1.2 布地奈德作用靶点的筛选及靶点信息的规范化 布地奈德相关基因通过人类基因数据库GeneCards（https://www.genecards.org/）输入关键词“Budesonide”获得，数据库更新截止时间为2023 年3 月。利用DrugBank 数据库（https://www.drugbank.ca）与TTD 数据库（https://db.idrblab.net/ttd/）对相关靶点进一步补充，所预测的药物靶点信息与Uriprot 数据库（https://www.uniprot.org/）进行规范化处理后确定为布地奈德主要靶点。

1.3 获取IgAN 相关靶基因 通过GeneCards 和CTD 数据库（http://ctdbase.org/），输入关键词“IgA nephropathy”，获得IgAN 相关基因。通常在GeneCards数据库中，当靶基因数目较多时可将Score 值＞中位数的靶基因作为疾病的潜在靶基因。本研究中通过GeneCards 获得的相关靶基因数目中等，因此未进行筛选，全部纳入研究。其中得到Score 最大值为73.96，最小值为0.26。利用CTD 数据库补充相关靶点，并使用韦恩图将两个数据库的结果取交集获得IgAN 的最终靶点。

1.4 布地奈德-IgAN 交集靶点 将布地奈德相关靶点与IgAN 靶点导入Venny 2.1.0 网站（https://bioinfogpcnb.csic.es/tools/venny/Index.html），通过韦恩图取交集获得共同靶点。

1.5 药物-疾病靶点的网络构建 将布地奈德和布地奈德-IgAN 共同靶基因导入Cytoscape 3.9.1 软件，构建药物-疾病靶点网络图。以“节点”表示药物成分与作用靶点，以“边”表示节点间的相互作用。

1.6 蛋白质- 蛋白质相互作用（protain-protain interaction，PPI）网络构建 在STRING 数据库（https://string-db.org/）中输入交集靶基因构建PPI 网络。将结果导入Cytoscape 3.9.1 软件，利用CytoNCA 插件计算各节点的度值和介数，≥度值中位数的靶点被定义为关键靶点。

1.7 GO 和KEGG 通路富集分析 通过Metascape 数据库（https://metascape.org）对共同靶基因进行GO 和KEGG 富集分析。GO 富集分析包括生物过程（biological process，BP）、细胞组成（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF）三部分。筛选条件Min Overlap 为3；P Value Cutoff 为0.01；Min Enrichment为1.5，并用微生信平台（http://www.bioinformatics.com.cn/）可视化分析结果。

2 结果

2.1 布地奈德及IgAN 相关靶点的筛选 药物布地奈德的基本信息见图1。共获得布地奈德靶点242 个，IgAN相关基因1 443 个。通过韦恩图取并集获得146 个布地奈德-IgAN 共同靶基因，约占总数的9.5%，见图2。

图1 布地奈德基本信息Figure 1 Basic information of budesonide

图2 布地奈德-IgAN 共同靶点韦恩图Figure 2 Venn diagram of the intersection of budesonide and IgA nephropathy targets

2.2 布地奈德-IgAN 共同靶基因网络分析 以布地奈德和146 个布地奈德-IgAN 共同靶基因构建“药物-疾病靶点”网络图，中心橙色节点代表布地奈德，周边146 个绿色节点代表布地奈德治疗IgAN 的潜在靶点，146 条边代表布地奈德-IgAN 之间的相互作用，见图3。

图3 布地奈德-IgAN 靶基因网络Figure 3 Budesonide-IgAN target genes network

2.3 PPI 网络分析 于STRING 数据库中输入146 个布地奈德-IgAN 共同靶基因，构建PPI 网络，设置筛选条件后获得143 个节点，1 022 条边，见图4。将结果导入Cytoscape 3.9.1 软件中，利用CytoNCA 插件计算各节点的度值和介数的中位数分别为34.0、810.67，以≥度值中位数对靶点进行筛选，共获得15 个关键靶基因：白介素6（IL-6）、肿瘤坏死因子（TNF）、白介素10（IL-10）、血管内皮生长因子A（VEGFA）、表皮生长因子受体（EGFR）等，见图5、表1。

表1 PPI 网络15 个关键靶基因及其拓扑参数Table 1 15 core target genes of PPI network and their topological parameters

图4 布地奈德-IgAN 交集靶点的PPI 网络图Figure 4 PPI network map of the intersection of budesonide and IgAN targets

图5 15 个关键靶基因Figure 5 15 core target genes

2.4 GO 富集分析 应用Metascape 数据库将146 个交集靶基因进行GO 功能富集，共得到1 646 个BP，62 个CC 及127 个MF，其中BP 主要涉及炎症反应（inflammatory response）、磷酸化的正向调节（positive regulation of phosphorylation）、细胞运动的正向调节（positive regulation of cell motility）等；CC 主要涉及囊腔（vesicle lumen）、细胞质囊泡腔（cytoplasmic vesicle lumen）、分泌颗粒腔（secretory granule lumen）等；MF主要涉及信号受体激活活性（signaling receptor activator activity）、 信号受体调节活性（signaling receptor regulator activity）、 受体配体活性（receptor ligand activity）等。使用微生信平台按照P 值排序将排名前20 的富集分析结果绘制出气泡图，图中圆点大小代表基因个数，颜色对应P 值大小，见图6～8。

图6 布地奈德治疗IgAN 关键靶点的GO-BP 富集分析Figure 6 GO-BP enrichment analysis of core targets of IgAN treated with budesonide

图7 布地奈德治疗IgAN 关键靶点的GO-CC 富集分析Figure 7 GO-CC enrichment analysis of core targets of IgAN treated with budesonide

图8 布地奈德治疗IgAN 关键靶点的GO-MF 富集分析Figure 8 GO-MF enrichment analysis of core targets of IgAN treated with budesonide

2.5 KEGG 信号通路富集分析 将146 个交集靶基因通过Metascape 数据库进行KEGG 富集分析，共获得174条信号通路。对前20 条信号通路制作KEGG 信号通路柱状图（图9），纵坐标是信号通路的名称，横坐标是富集在每条通路上基因的数目，不同的颜色代表不同的P 值，颜色越红，P 值越小，富集越明显，说明此通路与疾病的相关性越大。结果显示富集基因较多且富集明显的通路包括细胞因子-细胞因子受体相互作用（cytokine-cytokine receptor interaction）、白介素17 信号通路（IL-17 signaling pathway）、癌症中的通路（pathways in cancer）、肿瘤坏死因子信号通路（TNF signaling pathway）等。

图9 布地奈德治疗IgAN 关键信号通路Figure 9 Key signaling pathways of IgAN treated with budesonide

3 讨论

黏膜免疫缺陷导致半乳糖缺陷IgA1 分子（galactose-deficient IgA1，Gd-IgA1）的产生在IgAN 发病机制中具有重要意义［8］，因此，从病因出发寻找新型治疗方案是当前IgAN 的研究重点。

近年来，作为黏膜免疫系统最广泛、最重要的部位，肠道黏膜免疫系统在IgAN 发生、发展中的作用越来越受到关注［9］。肠道黏膜免疫系统拥有全身最广泛的黏膜相关淋巴组织——肠道相关淋巴组织（GALT），对肠道局部和全身免疫均发挥作用。其中，派尔集合淋巴结是GALT 中抗原采集和免疫诱导的主要部位，也是人体IgA1 分子的主要来源［10］，有促进B 细胞向分泌IgA 的浆细胞分化的微环境。B 细胞分化成IgA 浆细胞后，错位迁移至全身，导致循环Gd-IgA1 过多，可能是IgAN 发病的基础和源头［11］。布地奈德肠溶胶囊作为一种靶向肠道释放的糖皮质激素在IgAN 的治疗中显示出了独特的优势，其靶向释放于回肠末端的黏膜B 细胞，达到从上游减少诱发IgAN 的Gd-IgA1 产生从而治疗IgAN 的作用［7］。

本研究采用网络药理学方法对布地奈德治疗IgAN的作用机制进行了探索。研究结果表明IL-6、TNF、IL-10、VEGFA、EGFR 等处于布地奈德治疗IgAN 关键靶点的核心位置。IL-6、TNF-α、IL-10 均属于炎症细胞因子，IgAN 患者血清IL-6、TNF-α、IL-10 水平显著升高［12-13］。作为一种促炎细胞因子，IL-6 是肾上腺TOLL 样受体（TLR）9 激活介导IgA1 过度生成的主要分子之一，IL-6 不仅可以诱导Gd-IgA1 的过量产生，亦可介导系膜细胞增殖和基质扩张，并促进肾脏炎性细胞浸润，从而诱发疾病生成［14-15］；此外，临床研究显示IgAN 患者尿液IL-6 水平异常升高，与肾脏病理损伤呈正相关，提示IL-6 可作为一种无创性生物标志物，反应IgAN 的肾脏损伤情况［16］。TNF-α 可通过与IgAN 足细胞TNF-α 受体1（TNFR1）结合介导足细胞凋亡，从而引发蛋白尿［17-18］。IL-10 在IgAN 肾内的表达主要发生在肾小管区域，作为一种抗炎细胞因子，IL-10 可通过减少IL-1β 的合成来抑制炎症反应［19］，亦可下调TNF 的合成［20］。此外，一项在中国西北地区人群中展开的研究表明IL-10 是IgAN 患者的易感基因［21］，IL-10 基因G-1082A 多态性与IgAN 进展相关［22］。VEGFA 是一种重要的血管内皮生长因子，对维持肾小球内皮细胞、系膜细胞、足细胞和壁层上皮细胞的存活、分化和结构至关重要［23］，肾小管VEGFA 产生的增加会导致纤维化和肾小球病变［24］。VEGFA 在IgAN患者肾脏顶叶上皮细胞、肾小管上皮细胞、足细胞和系膜细胞中强烈表达，尿液VEGFA 水平与肾小管萎缩/间质纤维化显著相关，是IgAN 的独立预后因素［25］。EGFR 是一种多功能的信号转导子，过量的EGFR 可激活PI3K/Akt 通路，增加TGF-β1 的含量，促进肾脏纤维化，并增加炎症细胞因子的产生［26］。

对关键靶点进行GO 富集分析，其中BP 主要涉及磷酸化的正向调节、炎症反应、细胞运动的正向调节等，CC 主要涉及细胞质囊泡腔、囊腔、分泌颗粒腔等，MF 主要涉及信号受体激活活性、信号受体调节活性、受体配体活性等。KEGG 富集分析显示，布地奈德可通过多条信号通路调控IgAN，其中细胞因子与细胞因子受体相互作用的通路在布地奈德治疗IgAN 中起到了关键作用。细胞因子作为机体内最具有活性的可溶性多肽，从生物酶活力、细胞膜通透性、细胞骨架蛋白功能、基因表达等多方面参与机体生理病理状态，细胞因子-细胞因子受体网络是机体信号转导的重要组成部分，也是药物干预的靶点和核心环节［27］。IgAN 与黏膜感染相关，常伴有细胞因子升高，IgAN 患者细胞因子-细胞因子受体相互作用通路在细菌感染宿主的炎症过程中发挥着重要调控作用。其中IL-6 作为促炎因子，在机体发生感染时可发出炎症信号，促进免疫细胞增殖分化。在IgAN 患者中，IL-6 可通过调节ST6GALNAC2和C1GALT1 的基因表达及酶活性，上调IgA1 分子的半乳糖缺失，进而增加免疫复合物形成、促进疾病进展［28］。因而，布地奈德通过调控细胞因子-细胞因子受体相互作用通路抑制Gd-IgA1 合成在IgAN 的治疗中具有重要意义。

综上所述，本研究初步探讨了布地奈德治疗IgAN的药理学机制。布地奈德可能通过IL-6、TNF、IL-10、VEGFA、EGFR 等靶点作用于细胞因子-细胞因子受体相互作用通路、白介素17 信号通路、癌症中的通路、肿瘤坏死因子信号通路等多条信号发挥IgAN 治疗作用，为布地奈德治疗IgAN 进一步研究提供了理论依据，后续可通过基础实验进一步验证。

作者贡献：张康设计文章的思路与框架，绘制图表，撰写论文初稿；张波、高梦琦进行文献收集、整理和提炼；李昱熹、王邵鹏进行论文的修订；赵婷婷、赵文景负责论文终稿的审定，文章的质量控制及审校；张康、赵文景对文章整体负责，监督管理。

本文无利益冲突。