苯二氮 类药物检测提取技术的研究进展*

陈晓兵，李慧文，戴欣成，周 全，沙 鸥，吴赟帆，王滋文

（1.江苏海洋大学药学院，江苏 连云港 222005；2.连云港市第一人民医院，江苏 连云港 222061；3.江苏海洋大学环境与化学工程学院，江苏 连云港 222005；）

在我国，每年约有480 万重症医学科（Intensive Care Unit，ICU）患者，其中接受镇静治疗的患者占64%。为了帮助和改善患者睡眠、减轻和消除患者焦虑以及减轻患者器官应激负荷，保护器官储备功能，维持机体内环境稳定，研究者们一直在寻找一种能快速起效、有效镇静、安全指数高且副作用小的理想镇静药。苯二氮 类药物（Benzodiazepines，BZDs）是目前ICU 应用广泛的镇静治疗基本药物，属于第二代镇静催眠药。该类药物主要通过与脑内苯二氮 受体结合，促进γ 氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）与γ 氨基丁酸A 型受体结合，增加氯离子通道的开放频率，从而增强GABA 能神经的抑制效应，导致GABA 水平降低，去甲肾上腺素和多巴胺脱抑制性释放，机体即产生镇静作用[1]。

自1961 年首个苯二氮 类药物利眠宁诞生以来，已有近40 种结构相近、药理作用相似的该类药物相继应用于临床[2]，其中常见的主要有三唑仑（Triazolam）、地西泮（Diazepam）、咪达唑仑（Midazolam）、氯硝西泮（Clonazepam）、艾司唑仑（Estazdam）、瑞马唑仑（Remimazolam）等。这些药物的基本母核结构为含氮的稠环1，4 苯并二氮杂 ，因结构中都含有胺基，所以大多呈弱碱性，在强酸或强碱条件下易分解；另因具有环状结构，所以熔点、沸点较高且难挥发[3]。此类药物大多在肝药酶作用下代谢，代谢产物最终与葡萄糖醛酸结合而失活，经过肾脏排出。多数药物的代谢产物具有与母体药物相似的活性，而其半衰期（t1/2）则比母体药物更长，因此在体内易发生蓄积，产生不良反应[4]。为了弥补此类药物依赖肝肾代谢、易发生蓄积、半衰期延长等不足，专家学者们研制出了依赖血浆酯酶代谢的一类镇静新药—瑞马唑仑，并广泛应用于临床。由于BZDs 原料药物经体内代谢的代谢程度不同，所产生的后遗效应亦不同，因此对不同来源样品中苯二氮 类原料药物的分析监测在药物分析、食品安全及法医学鉴定中具有重要意义。

目前常用的有关BZDs 原料药的分析检测手段有免疫测定法、色谱法、光谱法等，常用的样品前处理方法有液-液萃取法、固相萃取法、固相微萃取法等。本文整理了近年来国内外发表的相关文献，对不同来源样品中苯二氮 类药物的检测手段和样品前处理方法进行了全面的分析，以期为研究机构和科研人员提供相关信息，并为BZDs 的科学研究奠定基础。

1 苯二氮 类药物的检测技术

1.1 免疫测定法

免疫测定法是指利用免疫学原理，以待测物作为抗原或抗体从而测定样品中待测物质含量的方法。免疫化学技术通常作为筛选试验，可确定微克级苯二氮 类药物的存在。Rossi B 等[5]使用了两种特异性较高的免疫测定法检测了人体尿液中的部分苯二氮 类物质，结果表明两种方法检测的物质结果均为阳性，是可靠的筛查方法。Huang W 等[6]用4 种免疫测定法检测血中去甲安定、三唑仑、洛拉西泮和阿普唑仑，结果表明检出限为3.0ng/ml，当浓度等于和低于1.0ng/ml 时，灵敏度受到限制。

1.2 联用技术

联用技术是指将色谱法、质谱法、光谱法等分析方法联合使用，以提高检测的准确度和精密度。

1.2.1 气相色谱-质谱联用技术

气相色谱-质谱联用技术（Gas Chromatographic-Mass Spectrometer，GC-MS）是将气相色谱法与质谱法结合，既弥补了GC 难以对复杂化合物中未知组分做出可靠的定性鉴定的缺点，又利用了鉴别能力很强且灵敏度极高的MS 作为检测器，在环保、医药、农药和兴奋剂等领域起着越来越重要的作用，是分离和检测复杂化合物的最有力工具之一。

Papoutsis II 等[7]在pH 为9 的条件下，用氯仿对人体血浆样品中地西泮等23 中常见的苯二氮 类药物进行液-液萃取，建立GC-MS 分析方法并进行优化，所有物质的提取回收率均高于74.00%。Qriouet Z 等[8]通过固相萃取法对血浆样品中的地西泮、阿普唑仑和氯硝西泮进行萃取，采用GC-MS 进行分析，该法测得地西泮、阿普唑仑和氯硝西泮的检测限分别为0.09 μg/ml、0.20 μg/ml 和0.77 μg/ml。Drummer OH[9]采用简单的液-液萃取法，通过GC-MS/MS 分析检测全血样品中的10 种苯二氮 类药物，测得10种该类药物的检测限和定量限分别在0.02～0.53 ng/ml 和1.0～2.0 ng/ml 范围内。Liu JL 等[10]用四氢呋喃和正己醇组成的超分子溶剂对尿液中的9 种苯二氮类药物进行分离富集，并采用GC-MS/MS 技术对该类药物进行含量测定，结果表明GC-MS/MS 法测定的定量下限为0.2～5.0 ng/ml，提取回收率均大于81.12%。

1.2.2 液相色谱-质谱联用技术

液-质联用技术（Liquid Chromatography-Mass Spectrometry，LC-MS）又叫液相色谱-质谱联用技术，它以液相色谱作为分离系统，质谱为检测系统。样品在质谱部分和流动相分离，被离子化后，经质谱的质量分析器将离子碎片按质量数分开，经检测器得到质谱图。液质联用体现了色谱和质谱优势的互补，将色谱对复杂样品的高分离能力，与MS 具有高选择性、高灵敏度及能够提供相对分子质量与结构信息的优点结合起来，在药物分析、食品分析和环境分析等许多领域得到了广泛的应用。

叶璞等[11]利用固相萃取结合HPLC-MS/MS 提取分析了医院污水处理系统中的17 种苯二氮 类物质，结果表明该类物质的排放均达标。Martin D 等[12]从犯罪现场的物品中用一次性拭子提取了表面苯二氮 类药物的残留，采用液-液微萃取结合HPLCHRMS/MS 系统进行定性和半定量分析，检测限在1～14 pg/ml，提 取 回 收 率 在77%～107%。Garcia L等[13]采用LC-MS/MS 开发了人体尿液和血浆样品中苯二氮 类药物的分析方法，并讨论了基于免疫分析的筛查方法的可行性，实验结果表明所检测的苯二氮 类药物的检测限均低于0.1 ng/ml。Mei V等[14]采用液质联用技术对于某死亡患者血液中的3-羟基苯那西泮、氯巴扎姆、氯硝唑仑等进行分析，血液样品体积为0.5ml，采用固相萃取技术对上述分析物进行萃取分离，所得分析物的检测限和定量限分别为0.5 ng/ml（信噪比＞3）和1 ng/ml，回收率在35%～90%。López-Rabuñal A 等[15]利用固相萃取技术与LC-MS/MS 联用提取分析了胎粪样品中的14 种苯二氮 类物质，得到的检测限为1～20 ng/g，提取回收率在35.9%～91.2%。

2 苯二氮 类药物的提取技术进展

由于苯二氮 类药物吸收快、代谢迅速且半衰期短[16]，所以在生物体液内的浓度很低，如唑仑类药物在血浆中的最大治疗浓度仅为0.02～0.25 μg/ml[17]，这就为实验室的检验工作带来了一些难度。因此，选择合适样品前处理方法，富集目标物并去除杂质很重要。目前所使用的提取方法有以下几种。

2.1 液-液萃取

液- 液 萃 取 法（Liquid-liquid extraction，LLE）是利用物质在两种互不相溶的溶剂中的溶解度或分配系数的不同，使物质从一种溶剂内转移到另外一种溶剂中，经过反复多次萃取，将待分析物提取出来。

Vogliardi S 等[18]以乙腈为萃取剂，采用低温分配快速液-液萃取法提取分析了人体尿液中的地西泮、劳拉西泮等药物，检测限均低于5.0 μg/L，提取回收率在72.4%～100.4%，且线性良好。易小翠[19]考察了大鼠血浆和尿液中的氯硝西泮等药物并优化了萃取溶剂的类型、萃取时间、萃取次数等萃取条件，实验结果表明在血浆样品中加入5 倍体积的乙酸丁酯振荡10 min 并提取一次得到的提取回收率较高，均大于90%；在尿液样品中加入10 倍体积的乙酸乙酯振荡10 min 并提取两次得到的提取回收率较高，均大于80%。de Paula C 等[20]为了识别毒品犯罪，采用低温分配液液萃取联合纸喷雾质谱法提取分析了饮料中的地西泮、氯硝西泮等物质，结果表明检测限为0.05 mg/L，提取回收率在90%～100%，在毒品犯罪领域有较好的研究前景。

2.2 固相萃取

固 相 萃 取 技 术（Solid Phase Extraction，SPE）是基于固-液相色谱理论发展而来的一项技术，通过选择性吸附和选择性洗脱对样品进行富集分离净化。由于固相萃取技术可提取微量待测物且避免液-液萃取的乳化现象，已成功应用于苯二氮 类药物的提取中。Stamper B 等[21]采用C18 柱快速提取人体尿液中的地西泮等21 中苯二氮 类药物，过柱后用乙腈和甲醇按比例洗脱，并结合LC-MS/MS 进行检测，检测限为0.5ng/ml，平均回收率为91%。Anderson RA 等[22]对尸检头发样本中的奥沙西泮等物质利用ZSDAU 020 柱进行提取，并用乙酸乙酯进行洗脱，检测限均低于0.6 ng/mg。杨霄等[23]利用C18 和N-丙基乙二胺作为吸附剂对水产品中的6 种苯二氮 类药物进行提取净化，并结合UPLC-MS进行检测，检测限为0.2～0.5 μg/kg，平均回收率为73.2%～110.6%。于峰等[24]同样使用C18 和N-丙基乙二胺作为吸附剂对干血斑样品中的奥沙西泮等物质进行富集纯化，实验结果表明该固相萃取方法简单、快速且灵敏度高。

2.3 固相微萃取

固相微萃取技术（Solid-Phase Microextraction，SPME）是在固相萃取技术基础上发展起来的一种萃取手段，因其操作简便、回收率高而被广泛应用。Abrão LCC 等[25]以地西泮为模板，甲基丙烯酸为功能单体合成了分子印记聚合物，对血浆样品中的苯二氮 类药物直接进行萃取，并用HPLC-DAD 进行检测，得到的检测限为15 μg/L。Asgharinezhad AA等[26]合成了聚苯胺磁性纳米复合物用于萃取人体血浆样品中的劳拉西泮和硝西泮，并优化了萃取条件，用HPLC-UV 进行检测，得到的检测限分别为0.2～2.0 μg/L、0.5～1.8 μg/L，提取回收率分别为84%～99%、90%～99%。Jinno K 等[27]利 用SPME 联 合 半 微 柱高效液相色谱法提取分析了人体尿液样品中的地西泮等物质，实验证明该方法简便、快速、使用溶剂量少。

2.4 磁固相萃取

近年来，基于固相萃取技术发展而来的新技术—磁固相萃取技术（Micro-Solid Phase Extraction，MSPE）在食品、环境、医药等领域发挥着巨大的应用潜力。MSPE 主要利用磁性或可磁化材料作为萃取剂对待测组分进行分离，通过外加磁铁将吸附剂与样品溶液分离。随后通过合适的洗脱液对吸附在萃取剂上的待测物进行洗脱，进而进入仪器检测。MSPE 因其操作简便、萃取剂可重复使用、可避免基质的干扰以及对痕量组分富集倍数高等优点，在分离分析领域广泛应用。

Plastiras OE 等[28]通过合成磁性纳米复合物（氧化石墨烯-磁性壳聚糖）选择性萃取地表水样中的阿替唑仑及氟硝西泮，然后使用HPLC-PDA 进行检测，得到的检测限分别为3 ng/ml 及10 ng/ml，提取回收率在93.6%～112.9%，且线性良好。杜梨[29]以硅藻土（Dt）为固相支撑材料，用原位生长法制备了ZIF-8@Dt-COOH 固相吸附萃取剂，结合高效液相色谱-二极管阵列检测，建立了人体尿液中三种苯二氮类药物（三唑仑、咪达唑仑和地西泮）的分析方法，得到的提取回收率在80.0%～98.7%。

3 总结与展望

苯二氮 类药物种类繁多，具有催眠、镇静、抗惊厥等药理作用，临床应用广泛，因此亟待开发更加灵敏、高通量、自动化的提取分析手段。本文旨在对不同来源样品中的苯二氮 类药物的检测方法和提取手段进行综述，为建立兼顾精准度和推广性的苯二氮 类药物检测的前处理和仪器检测技术提供意见和发展方向。